书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３２３ — ２００７ 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱  质谱 ／ 质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犿犻狀狅犵犾狔犮狅狊犻犱犲狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犪狀犻犿犪犾狋犻狊狊狌犲狊 — 犎犘犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国湖南出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫 局 、 湖南师范大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 黄志强 、 林黎明 、 张鸿伟 、 张莹 、 陈波 、 彭涛 、 李晓娟 、 王美玲 、 颜鸿飞 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３２３ — ２００７ 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱  质谱 ／ 质谱法 １ 　 范围 本标准规定了动物组织中壮观霉素 、 潮霉素 Ｂ 、 双氢链霉素 、 链霉素 、 丁胺卡那霉素 、 卡那霉素 、 安普 霉素 、 妥布霉素 、 庆大霉素和新霉素 １０ 种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱  串联质谱测定和确证 方法 。 本标准适用于动物内脏 、 肌肉和水产品中 １０ 种氨基糖苷类药物残留量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 试样中氨基糖苷类药物残留 ， 采用磷酸盐缓冲液提取 ， 经过 Ｃ １８ 固相萃取柱净化 ， 浓缩后 ， 使用七氟 丁酸作为离子对试剂 ， 高效液相色谱  质谱 ／ 质谱测定 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 液相色谱级 。 ４ ． ２ 　 冰乙酸 ： 液相色谱级 。 ４ ． ３ 　 甲酸 ： 液相色谱级 。 ４ ． ４ 　 七氟丁酸 ： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． ５ 　 浓盐酸 。 ４ ． ６ 　 氢氧化钠 。 ４ ． ７ 　 三氯乙酸 ： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． ８ 　 乙二胺四乙酸二钠 （ Ｎａ ２ ＥＤＴＡ ）： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． ９ 　 磷酸二氢钾 。 ４ ． １０ 　 七氟丁酸溶液 （ ＨＦＢＡ ）： １００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， 准确量取 ６．５ｍＬ 七氟丁酸 （ ４．４ ）， 用水稀释至 ５００ｍＬ （ ４℃ 避光可保存 ６ 个月 ）。 ４ ． １１ 　 七氟丁酸溶液 ： ２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， 准确量取 １００ｍｍｏｌ ／ Ｌ 七氟丁酸溶液 ５０ｍＬ （ ４．１０ ）， 用水稀释至 ２５０ｍＬ （ ４℃ 避光可保存 ６ 个月 ）。 ４ ． １２ 　 磷酸盐缓冲液 （ 含 ０．４ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ 和 ２％ 三氯乙酸溶液 ）： 准确称取磷酸二氢钾 （ ４．９ ） １．３６ｇ ， 用 ９８０ｍＬ 水溶解 ， 用 １．０ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸调 ｐＨ 到 ４．０ ， 分别加入 Ｎａ ２ ＥＤＴＡ （ ４．８ ） ０．１５ｇ 和三氯乙酸 （ ４．７ ） ２０ｇ ， 溶解混匀并定容至 １０００ｍＬ （ ４℃ 避光可保存 １ 个月 ）。 ４ ． １３ 　 甲酸 ： ０．１％ （ 体积分数 ）， 准确吸取 １．０ｍＬ 甲酸 （ ４．３ ） 于 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水稀释至刻度 ， 混匀 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３２３ — ２００７ ４ ． １４ 　 壮观霉素 、 潮霉素 Ｂ 、 双氢链霉素 、 链霉素 、 丁胺卡那霉素 、 卡那霉素 、 安普霉素 、 妥布霉素 、 庆大霉 素 、 新霉素标准品 ： 纯度范围 ９２．０％ ～ ９９％ 。 ４ ． １５ 　 １０ 种氨基糖苷类药物标准贮备液 ： 分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品 （ ４．１４ ）， 用 水溶解 ， 配制成浓度为 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 的标准贮备溶液 （ ４℃ 避光可保存 ６ 个月 ）。 ４ ． １６ 　 １０ 种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液 ： 分别准确量取壮观霉素 、 双氢链霉素 、 链霉素 、 丁胺卡 那霉素 、 卡那霉素 、 妥布霉素 、 庆大霉素标准贮备溶液 （ ４．１５ ） 各 １．０ｍＬ ， 新霉素 、 潮霉素 Ｂ 、 安普霉素标 准贮备溶液 （ ４．１５ ） 各 ５．０ｍＬ ， 于 ２５ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 ， 配制成壮观霉素 、 双氢链霉素 、 链 霉素 、 丁胺卡那霉素 、 卡那霉素 、 妥布霉素和庆大霉素浓度为 ４．０ μ ｇ ／ ｍＬ ， 新霉素 、 潮霉素 Ｂ 和安普霉素 浓度为 ２０．０ μ ｇ ／ ｍＬ 的混合标准中间溶液 （ ４℃ 避光可保存 １ 个月 ）。 ４ ． １７ 　 １０ 种氨基糖苷类药物标准工作溶液 ： 精密量取标准中间溶液 （ ４．１６ ） 适量 ， 用空白样品基质配制 成不同浓度系列的混合标准工作溶液 （ 现用现配 ）。 ４ ． １８ 　 固相萃取 Ｃ １８ 柱 ： ５００ｍｇ ， ３ｍＬ 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 高效液相色谱  串联质谱仪 ： 配有电喷雾离子源 。 ５ ． ２ 　 高速组织捣碎机 。 ５ ． ３ 　 均质器 。 ５ ． ４ 　 旋转蒸发器 。 ５ ． ５ 　 氮吹仪 。 ５ ． ６ 　 ｐＨ 计 。 ５ ． ７ 　 分析天平 ： 感量 ０．１ｍｇ 和 ０．０１ｇ 各一台 。 ５ ． ８ 　 真空泵 。 ５ ． ９ 　 离心机 。 ６ 　 试样制备与保存 ６ ． １ 　 试样制备 样品经高速组织捣碎机均匀捣碎 ， 用四分法缩分出适量试样 ， 均分成两份 ， 装入清洁容器内 ， 加封后 作出标记 ， 一份作为试样 ， 一份作为留样 。 ６ ． ２ 　 试样的保存 将试样于 －１８℃ 下保存 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 提取 称取约 ５ｇ （ 精确至 ０．０１ｇ ） 试样于 ５０ｍＬ 聚丙烯离心管中 ， 加入 １０．０ｍＬ 磷酸盐缓冲液 （ ４．１２ ） 均 质 ２ｍｉｎ ， 于平板振荡器上振荡提取 １０ｍｉｎ ， 离心 １０ｍｉｎ （ ４５００ｒ ／ ｍｉｎ ）， 将上清液转移到另一个 ５０ｍＬ 聚丙烯离心管中 。 在残渣中再加入 １０．０ｍＬ 磷酸盐缓冲液 （ ４．１２ ）， 重复上述操作 ， 合并上清液 ， 用 １．０ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸调 ｐＨ 值为 ３．５±０．２ ， 加入 ２．０ｍＬ 七氟丁酸溶液 （ ４．１０ ）， 涡旋混匀 。 ７ ． ２ 　 净化 Ｃ １８ 固相萃取柱用 ３．０ｍＬ 甲醇 （ ４．１ ）， ３ｍＬ 七氟丁酸溶液 （ ４．１１ ） 淋洗后 ， 将提取液加载在固相萃取 柱上 ， 控制流速约 １ 滴 ／ ｓ ， 先用 ３ｍＬ 七氟丁酸溶液 （ ４．１１ ） 淋洗 ， 再用每次 ３ｍＬ 水淋洗两次 ， 弃去淋洗 液 ， 抽干 ５ｍｉｎ 。 用 ５ｍＬ 乙腈  七氟丁酸溶液 （ ４．１１ ）（ ８０＋２０ ， 体积比 ） 洗脱 ， 收集洗脱液于精密刻度试 管中 ， ４０℃ 氮气流挥去部分溶剂 ， 用七氟丁酸溶液 （ ４．１１ ） 定容至 １．０ｍＬ ， 涡旋混匀后 ， 过 ０．２ μ ｍ 微孔滤 膜 ， 液相色谱  质谱 ／ 质谱测定 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３２３ — ２００７ ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 标准工作曲线制备 制备混合标准浓度系列 ， 壮观霉素 、 双氢链霉素 、 链霉素 、 丁胺卡那霉素 、 卡那霉素 、 妥布霉素 、 庆大 霉素分别为 ５０ｎｇ ／ ｍＬ 、 １００ｎｇ ／ ｍＬ 、 ２５０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ５００ｎｇ ／ ｍＬ 、 １０００ｎｇ ／ ｍＬ ， 新霉素 、 潮霉素 Ｂ 、 安普霉素 分别为 ３００ｎｇ ／ ｍＬ 、 ５００ｎｇ ／ ｍＬ 、 １０００ｎｇ ／ ｍＬ 、 １５００ｎｇ ／ ｍＬ 、 ２０００ｎｇ ／ ｍＬ ， 按 ７．３．２ 条件测定并制作 标准曲线 ， １０ 种氨基糖苷类药物的 ＣＡＳ 号和在 ７．３．２ 色谱条件下测得的色谱保留时间参见表 Ｂ．１ 。 ７ ． ３ ． ２ 　 液相色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 （ 可用 ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ３ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 柱长 １５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ 或相当者 ）； ｂ ） 　 流动相 ： 甲醇 ＋ 水 ＋１００ｍｍｏｌ ／ ＬＨＦＢＡ （ 梯度洗脱 ）， 流动相组成和洗脱梯度见表 １ ； 表 １ 　 流动相组成和洗脱梯度 时间 ／ ｍｉｎ 甲醇 ／ ％ 水 ／ ％ １００ｍｍｏｌ ／ ＬＨＦＢＡ ／ ％ ０ ５ ７５ ２０ ０．５ ５ ７５ ２０ １．０ ６０ ２０ ２０ １２．０ ７０ １０ ２０ １２．１ ８０ ０ ２０ １５．０ ８０ ０ ２０ １５．