书 书 书犐犆犛 ６５ ． １５０ 犅 ５０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １２ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１２ — ２００２ 养殖鱼类种质检验 第 １２ 部分 ： 染色体组型分析 犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵犲狉犿狆犾犪狊犿犳狅狉犮狌犾狋狌狉犲犱犳犻狊犺犲狊 — 犘犪狉狋 １２ ： 犕犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犽犪狉狔狅狋狔狆犲犪狀犪犾狔狊犻狊 ２００８  ０７  ３１ 发布 ２００８  １１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 《 养殖鱼类种质检验 》 分为下列部分 ： ——— 第 １ 部分 ： 检验规则 ； ——— 第 ２ 部分 ： 抽样方法 ； ——— 第 ３ 部分 ： 性状测定 ； ——— 第 ４ 部分 ： 年龄与生长的测定 ； ——— 第 ５ 部分 ： 食性分析 ； ——— 第 ６ 部分 ： 繁殖性能的测定 ； ——— 第 ７ 部分 ： 生态特性分析 ； ——— 第 ８ 部分 ： 耗氧率与临界窒息点的测定 ； ——— 第 ９ 部分 ： 含肉率测定 ； ——— 第 １０ 部分 ： 肌肉营养成分的测定 ； ——— 第 １１ 部分 ： 肌肉中主要氨基酸含量的测定 ； ——— 第 １２ 部分 ： 染色体组型分析 ； ——— 第 １３ 部分 ： 同工酶电泳分析 ； ——— 第 １４ 部分 ： ＤＮＡ 含量的测定 ； ——— 第 １５ 部分 ： ＲＡＰＤ 分析 ； …… 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的第 １２ 部分 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１２ — ２００２ 《 养殖鱼类种质检验 　 第 １２ 部分 ： 染色体组型分析 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１２ — ２００２ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了数码照相等先进技术 ； ——— 对 ７．２．９ 中的低渗时间进行了调整修订 ； 对 ５．４ 中碳酸氢钠 （ ＮａＨＣＯ ３ ） 的浓度做了补充说明 ； 对 ３．６ 、 ７．２．４ 、 ７．２．１２ 、 ７．３．２ 和 ８．３ 中描述的部分操作方法予以修改补充 ； 对第 ６ 章中仪器设 备予以补充完善 ； ——— 对第 ３ 章至第 ８ 章中的部分实验描述修改准确 ， 对部分文字描述予以更正 ； ——— 对附录 Ａ．３．４ 和 Ａ．３．５ 中部分文字描述予以修订 ， 增加 Ｂ．２．１ 数码显微照相内容 。 本部分的附录 Ａ 和附录 Ｂ 为资料性附录 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口 。 本部分起草单位 ： 中国水产科学研究院长江水产研究所 。 本部分主要起草人 ： 方耀林 、 周瑞琼 、 邹世平 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１２ — ２００２ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １２ — ２００８ 养殖鱼类种质检验 第 １２ 部分 ： 染色体组型分析 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的本部分规定了鱼类染色体组型分析的原理 、 试剂和材料 、 仪器和设备 、 玻片标本的 制备和组型分析 。 本部分适用于养殖鱼类染色体组型分析 ， 对于自然种群鱼类及其他水生动物亦可参照执行 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．２ 　 养殖鱼类种质检验 　 第 ２ 部分 ： 抽样方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４ 的本部分 。 ３ ． １ 　　 体细胞体外培养法 　 狊狅犿犪狋犻犮犮犲犾犾犮狌犾狋狌狉犲犻狀狏犻狋狉狅 通过无菌操作 ， 获取鱼的肾脏组织细胞或血细胞 ， 在体外培养过程中 ， 加入细胞分裂刺激物 ， 刺激淋 巴细胞大量进入分裂状态 。 然后 ， 加入适当浓度的秋水仙素 ， 使细胞分裂被阻抑在分裂中期 ， 而获得鱼 类细胞染色体中期分裂相 。 ３ ． ２ 　　 体细胞体内培养法 　 狊狅犿犪狋犻犮犮犲犾犾犮狌犾狋狌狉犲犻狀狏犻狏狅 通过向鱼体内注射细胞分裂刺激物 ， 刺激淋巴细胞大量进入分裂状态 。 取出头肾组织在生理盐水 中将其充分撕碎 ， 再加入适当浓度的秋水仙素 。 ３ ． ３ 　　 体细胞直接法 　 犱犻狉犲犮狋犿犲狋犺狅犱狅犳狊狅犿犪狋犻犮犮犲犾犾狊 将小鱼浸泡在适当浓度的秋水仙素溶液中 ， 使其分裂旺盛的鳃丝上皮细胞被阻抑在分裂中期 ， 而获 得鱼类细胞染色体中期分裂相 。 ３ ． ４ 　　 胚胎细胞直接法 　 犱犻狉犲犮狋犿犲狋犺狅犱狅犳犲犿犫狉狔狅犮犲犾犾狊 选用发育正常的囊胚期或原肠期早期胚胎 ， 将其细胞吹打分散后 ， 加入适当浓度的秋水仙素 ， 将细 胞阻抑在分裂中期 ， 获得鱼类细胞染色体中期分裂相 。 ３ ． ５ 　　 空气干燥法 　 犪犻狉犱狉狔犻狀犵狋犲犮犺狀犻狇狌犲 将收集的细胞经过低渗 、 固定 、 滴片 ， 然后斜放静置 ， 待其自然干燥 。 ３ ． ６ 　　 火焰干燥法 　 犳犾犪犿犲犱狉狔犻狀犵狋犲犮犺狀犻狇狌犲 将收集的细胞经过低渗 、 固定 、 滴片 ， 然后立即将玻片置于酒精灯的火焰上均匀烘烤 （ 以玻片上刚出 １ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １２ — ２００８ 现蓝色火焰为宜 ）， 或直接将玻片置于火焰上滴片 。 ３ ． ７ 　　 臂比 　 犪狉犿狉犪狋犻狅 染色体的长臂长度与短臂长度之比 。 ３ ． ８ 　　 相对长度 　 狉犲犾犪狋犻狏犲犾犲狀犵狋犺 每条染色体长度与单倍体组染色体总长度之比 ， 以百分值或千分值表示 。 ４ 　 原理 使用细胞分裂刺激物刺激鱼类淋巴细胞分裂 ， 或者直接收集细胞分裂旺盛的鳃丝上皮细胞 、 胚胎细 胞 。 然后利用秋水仙素破坏纺锤丝 ， 使细胞分裂阻抑在分裂中期 ， 再经低渗 、 固定 、 滴片和染色 ， 最后进 行镜检分析 。 ５ 　 试剂和材料 ５ ． １ 　 肝素溶液 ： 在无菌状态下 ， 用灭菌蒸馏水配制浓度为 ５００ＩＵ ／ ｍＬ 的肝素溶液 。 ５ ． ２ 　 小牛或胎牛血清 。 ５ ． ３ 　 青霉素 、 链霉素和卡那霉素 。 ５ ． ４ 　 培养基 ： ＴＣ１９９ 、 ＲＰＭＩ１６４０ 或 ＥａｇｌｅｓＭＥＭ ， 培养基应高压灭菌 。 培养液配制方法 ： 上述培养基和小牛或胚牛血清的体积比为 ４∶１ ， 每毫升培养液含青霉素 、 链霉 素 、 卡那霉素分别为 １００ＩＵ 、 １００ｍｇ 和 ５０ＩＵ ， 用无菌水配制 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 碳酸氢钠 （ ＮａＨＣＯ ３ ） 溶液 ， 调至 ｐＨ７．２ 。 ５ ． ５ 　 植物血球凝集素 （ ＰＨＡ ） 溶液 ， 根据厂家推荐剂量 ， 用无菌生理盐水配制 。 ５ ． ６ 　 生理盐水 ： ０．７５％ ～ ０．８５％ 的氯化钠 （ ＮａＣｌ ） 溶液 ， 应高压灭菌 。 ５ ． ７ 　 秋水仙素溶液 ： 浓度为 ２０ μ ｇ ／ ｍＬ ～ ４０ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ５ ． ８ 　 甲醇 。 ５ ． ９ 　 冰乙酸 。 ５ ． １０ 　 固定液 ： 甲醇和冰乙酸混合液 （ 体积比为 ３∶１ ）， 现用现配 。 ５ ． １１ 　 低渗溶液 ： ０．０３７５ｍｏｌ ／ Ｌ 氯化钾 （ ＫＣｌ ） 溶液 。 ５ ． １２ 　 吉姆萨 （ Ｇｉｅｍｓａ ） 原液 ： ０．５ｇＧｉｅｍｓａ 粉 、 甘油 ３３ｍＬ ， 在研钵内用少量甘油与 Ｇｉｅｍｓａ 粉混合 ， 研 磨至无颗粒时 ， 再将剩余甘油倒入 ， 在 ５６℃ 条件下保温 ２ｈ 后 ， 加入 ３３ｍＬ 甲醇 ， 保存于棕色瓶内 。 ５ ． １３ 　 磷酸缓冲液 （ ＰＢＳ ）： 浓度为 ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ ， 配制方法见表 １ 。 表 １ 　 不同 狆犎 值的 犘犅犛 配方 单位为毫升 ｐＨ 值 Ａ 液 ［ ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ）］ Ｂ 液 ［ ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸二氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ ）］ ６．８ ４９．０ ５１．０ ７．０ ６１．０ ３９．０ ７．２ ７２．０ ２８．０ ７．４ ８１．０ １９．０ ６ 　 仪器和设备 ６ ． １ 　 无菌室或超净工作台 。 ６ ． ２ 　 恒温培养箱或二氧化碳培养箱 。 ６ ． ３ 　 离心机 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １８６５４ ． １２ — ２００８ ６ ． ４ 　 天平 （ 感量 ０．０００１ｇ ）。 ６ ． ５ 　 显微镜 （ 带显微摄影 ）。 ６ ． ６ 　 照相机 、 １５° 黑白胶卷 、 ４ 号相纸和整套暗室设备 ； 或数码相机和生物图像分析系统 。 ６ ． ７ 　 游标卡尺 （ 精度 ０．０１ｍｍ ）。 ６ ． ８ 　 控温电热板 。 ６ ． ９ 　 解剖工具一套 。 ６ ． １０ 　 注射器及针头 。 ６ ． １１ 　 移液器 １０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 。 ６ ． １２ 　 细口吸管 、 吸管 、 ５ｍＬ ～ １０ｍＬ 离心管 、 冰冻及干热载玻片 。 ６ ． １３ 　 ２５ｍＬ 培养瓶或青 、 链霉素小瓶 ， 瓶塞等 。 ６ ． １４ 　 酒精灯 。 ６ ． １５ 　 碘酒或