ICS65.020.30 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T28630.3—2012 白 斑综合征(WSD)诊断规程 第3部分:原位杂交检测法 Diagnosticprotocolsforwhitespotdisease— Part3:Insituhybridizationmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 GB/T28630《白斑综合征(WSD)诊断规程》分为五个部分: ———第1部分:核酸探针斑点杂交检测法; ———第2部分:套式PCR检测法; ———第3部分:原位杂交检测法; ———第4部分:组织病理学诊断法; ———第5部分:新鲜组织的T-E染色法。 本部分为GB/T28630的第3部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。 本部分主要起草人:黄倢、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。 ⅠGB/T28630.3—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第3部分:原位杂交检测法 1 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征原位杂交检测法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤和 结果判定。 本部分适用于进行对虾及白斑综合征的其他敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估 和疾病的确诊。不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。 GB/T28630.1—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 GB/T28630.4—2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 3 原理 3.1 白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4—2012的2.1。 3.2 技术原理 原位杂交检测方法是以非放射性标记物———地高辛(DIG)标记的白斑综合征病毒(WSSV)核酸探 针与存在于切片中的WSSVDNA进行核酸分子杂交,并通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应 在组织切片上显示出WSSV的存在位点。原位杂交可完整保持组织与细胞形态,能在复杂组织中对单 一细胞进行病毒检测,准确反映组织细胞中病毒的分布。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.2 核酸探针按GB/T28630.1—2012中6.2的规定。 4.3 碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG,0.75U/μL,4℃):生化试剂。 4.4 二甲苯。 4.5 无水乙醇。 4.6 95%乙醇。 4.7 中性树胶:生物染色用。 4.8 石蜡(熔点52℃~54℃):切片级。 4.9 戴维森氏AFA(Davidson’sAFA)固定液:见附录A的规定。 1GB/T28630.3—2012 4.10 80%乙醇:见附录A的规定。 4.11 70%乙醇:见附录A的规定。 4.12 50%乙醇:见附录A的规定。 4.13 500μg/mL多聚赖氨酸:见附录A的规定。 4.14 2×SSC:见附录A的规定。 4.15 1×SSC:见附录A的规定。 4.16 0.5×SSC:见附录A的规定。 4.17 TNE:见附录A的规定。 4.18 100μg/mL蛋白酶K:见附录A的规定。 4.19 0.4%甲醛:见附录A的规定。 4.20 杂交缓冲液:见附录A的规定。 4.21 缓冲液Ⅰ:见附录A的规定。 4.22 缓冲液Ⅱ:见附录A的规定。 4.23 缓冲液Ⅲ:见附录A的规定。 4.24 缓冲液Ⅳ:见附录A的规定。 4.25 显影液:见附录A的规定。 4.26 0.5%俾斯麦棕Y(BismarkbrownY):见附录A的规定。 4.27 阳性对照为受WSSV感染且组织病理学上有明显WSSV病灶的对虾组织切片(未脱蜡)。 4.28 阴性对照为未受WSSV感染且经原位杂交证明为阴性的对虾组织切片(未脱蜡)。 5 器材和设备 5.1 石蜡切片机:满足4μm~7μm厚度的石蜡连续切片要求。 5.2 水浴锅:室温至100℃,上下波动1℃。 5.3 显微镜:带高倍镜(40×)和油镜(100×)。 5.4 微量移液器:量程0.5μL~10μL、5μL~40μL、40μL~200μL、200μL~1000μL各1支。 5.5 普通冰箱:具冷藏箱,并带-18℃以下冷冻箱体。 5.6 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。 5.7 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤。 5.8 程控切片染色机或使用手工染色步骤。 5.9 切片保湿孵育箱:室温至50℃,上下波动1℃或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中。 5.10 展片水浴锅:敞口,无盖水浴锅或使用自制保温盒内加一定温度的水代替。 5.11 平板烘片机:室温至100℃或使用恒温箱代替。 5.12 切片染色杯。 5.13 医用镊子。 5.14 毛笔。 5.15 玻片架。 5.16 吸管。 5.17 载玻片。 5.18 盖玻片。 5.19 吸水纸。 5.20 暗盒:可用任何能避免强光直射的盒子。 2GB/T28630.3—2012 6 操作步骤 6.1 组织切片制备 6.1.1 样品采集的要求、固定方法和修整取材见GB/T28630.4—2012中附录B的规定。 6.1.2 样品按GB/T28630.4—2012中5.2~5.5的规定将样品在程控组织脱水机中进行脱水、透明、 浸蜡,在石蜡包埋机上进行包埋,用石蜡切片机进行切片,切片厚度5μm。用毛笔将切片移入展片水浴 锅内展片,用已预包被500μg/mL多聚赖氨酸的载玻片捞出,置于平板烘片机上65℃烘烤45min。 6.2 原位杂交 6.2.1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(3次,5min/次)、 无水乙醇(2次,1min/次)、95%乙醇(2次,10s/次)、80%乙醇(2次,10s/次)、50%乙醇(1次, 10s/次),然后用蒸馏水冲洗6次(勿让切片干燥)。 6.2.2 组织切片置于TNE中5min,而后平放在切片保湿孵育箱中,吸取500μL100μg/mL蛋白酶 K溶液,加于每张组织切片上,37℃孵育15min。 6.2.3 把组织切片上的蛋白酶K溶液吸干,然后将其放入预冷到4℃的0.4%甲醛溶液中浸5min。 6.2.4 室温下,用2×SSC浸洗组织切片5min。 6.2.5 把组织切片平放在切片保湿孵育箱中,吸500μL杂交缓冲液于每张组织切片上,42℃孵育 30min。 6.2.6 按每毫升杂交缓冲液中加入1μL~4μL核酸探针的用量取核酸探针置于一只微量离心管中, 在100℃沸水中将含核酸探针溶液的离心管煮沸10min,然后置于碎冰中淬冷。 6.2.7 将上述核酸探针与相应量(每张切片应500μL)的杂交缓冲液混合,吸取500μL混合液于每张 组织切片上,置于90℃~95℃平板烘片机上保温6min~10min,使组织DNA变性。注意补充切片上 过度蒸发的杂交缓冲液。 6.2.8 把组织切片放在平整的冰上淬冷5min。 6.2.9 在切片保湿孵育箱内42℃下孵育16h~18h。 6.2.10 用缓冲液2×SSC(15min,室温)、1×SSC(5min,室温)、0.5×SSC(15min,42℃)、0.5× SSC(15min,42℃)、缓冲液Ⅰ(5min,室温)洗组织切片。 6.2.11 用缓冲液Ⅱ封闭组织切片(500μL/片),37℃温浴30min。 6.2.12 用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75U/mL(1μL0.75U/μLAP-抗DIG加到1mL缓冲液 Ⅱ中),把组织切片平放在湿盒中,每片吸250μL已用缓冲液Ⅱ稀释的AP-抗DIG于组织切片上,37℃ 温浴30min。 6.2.13 用缓冲液Ⅰ(2次,10min/次,室温)、缓冲液Ⅲ(1次,5min,室温)洗玻片。 6.2.14 吸500μL显影液于每张组织切片上,室温下黑暗中放置1h~3h。中间可取出短时间在显微 镜下观察显色情况,当阳性对照有明显显色时可中止反应,如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特 异性显色,则应立即终止显色。 6.2.15 室温下把组织切片置于缓冲液Ⅳ中15min终止反应。 6.2.16 组织切片上滴加双蒸水(1次,10s/次)、0.5%俾斯麦棕Y(1次,1min/次)、95%乙醇(3次, 10s/次)、无水乙醇(3次,10s/次)、二甲苯(4次,10s/次)。 6.2.17 滴加2滴中性树胶封片。 6.2.18 在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色的细胞内沉淀物并拍照。 3GB/T28630.3—2012 7 结果判定 7.1 受WSSV感染的细胞显示阳性反应,即细胞核内有较深的蓝黑色颗粒沉淀,而阴性结果则无此沉 淀。感染程度越深,则着色越明显。对虾甲壳上的显色是非特异性反应所致,如果加有核酸探针和杂交 缓冲液的切片在90℃~95℃平板烘片机上保温6min~10min过程中,因缓冲液蒸发而使组织干燥, 干燥部分也会出现非特异性反应。 7.2 阳性对照样品不显阳性反应或阴性对照样品出现与阳性显色反应程度相当的非特异性反应,判断 检测结果无效,重新取样检测。 4GB/T28630.3—2