ICS67.120 B51 中华人民共和国国家标准 GB/T33108—2016 海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法 Determinationofseacucumberglycosidesinseacucumberandsea cucumberproducts— Highperformanceliquidchromatography 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位:青岛市产品质量监督检验研究院、中国海洋大学。 本标准主要起草人:薛长湖、李昭勇、樊燕、刘小芳、武千钧、杨洁。 ⅠGB/T33108—2016 海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了海参及其制品中海参皂苷含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于海参及其制品中海参皂苷含量(以喹诺糖计)的测定,喹诺糖为海参皂苷特征性单糖。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30891 水产品抽样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 喹诺糖 quinovose 6-脱氧葡萄糖 6-Deoxy-D-gulcose 分子式C6H12O5,相对分子质量164.16。 广泛存在于海参皂苷糖链中,每个海参皂苷分子中有且仅含有一个喹诺糖单元。 3.2 海参皂苷 seacucumberglycosides 由羊毛甾烷衍生物和低聚糖组成的三萜皂苷化合物,其中喹诺糖为其稳定的特征性单糖。 4 原理 样品经乙醇提取、正丁醇萃取得到海参皂苷,再经三氟乙酸水解,水解液中喹诺糖与1-苯基-3-甲 基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生反应,产物经C18色谱柱分离,高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定 量,以喹诺糖含量标示样品中海参皂苷的含量。 5 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯试剂。 5.1 水为符合GB/T6682规定的一级水。 5.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。 5.3 乙腈(CH3CN):色谱纯。 5.4 乙醇(CH3CH2OH)。 1GB/T33108—2016 5.5 正丁醇[CH3(CH2)2CH2OH]。 5.6 三氯甲烷(CHCl3):色谱纯。 5.7 氢氧化钠(NaOH)。 5.8 盐酸(HCl)。 5.9 磷酸二氢钾(KH2PO4)。 5.10 三氟乙酸(CF3COOH)。 5.11 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP):使用前用甲醇重结晶两次。将PMP加入到甲醇中加热(60℃~ 64℃)溶解制成饱和溶液,冰水混合物冷却,析出晶体,抽滤洗涤晶体,重复结晶一次。 5.12 喹诺糖标准品:纯度≥98.0%,CAS号7658-08-4。 5.13 乙醇溶液(60%):量取60mL乙醇,加40mL水,混匀。 5.14 盐酸溶液(0.3mol/L):量取2.5mL分析纯盐酸(5.8),用水稀释并定容至100mL。 5.15 三氟乙酸溶液(2mol/L):称取22.8g三氟乙酸(5.10),用水稀释并定容至100mL。 5.16 氢氧化钠溶液(4mol/L):称取16.0g氢氧化钠(5.7),用水稀释并定容至100mL。 5.17 氢氧化钠溶液(0.3mol/L):称取1.2g氢氧化钠(5.7),用水稀释并定容至100mL。 5.18 PMP衍生剂溶液(0.5mol/L):称取8.71g重结晶后的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(5.11), 用甲醇溶解并定容至100mL。4℃保存,有效期1个月。 5.19 喹诺糖标准储备液(324mg/L):称取喹诺糖标准品(5.12)3.24mg,用水溶解并定容至10mL。 4℃密封保存,有效期1个月。 5.20 喹诺糖标准工作液:准确移取适量喹诺糖标准储备液(5.19),用水稀释成浓度为6.48mg/L, 12.96mg/L,19.44mg/L,25.92mg/L,32.4mg/L的喹诺糖系列标准工作液,当天配制,现用现配。 5.21 0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液:称取6.80g磷酸二氢钾(5.9),溶于约900mL水中,用氢氧化钠溶 液(5.16)调节pH至5.1~5.3,用水定容至1L,0.45μm滤膜过滤,现用现配。 5.22 磷酸盐-乙腈溶液:取乙腈(5.3)220mL,用0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(5.21)稀释至1000mL, 用氢氧化钠溶液(5.16)调节pH至5.2。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。 6.2 分析天平:精度0.01mg。 6.3 均质机。 6.4 涡旋振荡器。 6.5 高速万能粉碎机。 6.6 旋转蒸发仪。 6.7 恒温水浴。 6.8 微孔滤膜:0.45μm。 6.9 反应管:15mL,螺口,带聚四氟乙烯衬垫。 6.10 5mL容量瓶。 6.11 5mL安瓿瓶。 6.12 10mL具塞试管。 7 测定方法 7.1 抽样 产品抽样按GB/T30891的规定进行。 2GB/T33108—2016 7.2 试样制备 7.2.1 鲜海参 去肠腺、灰嘴,剪成约0.5cm×0.5cm的小块,匀浆备用。 7.2.2 干海参 粉碎,过0.850mm筛,混匀备用。 7.2.3 即食海参及盐渍海参 剪成约0.5cm×0.5cm的小块,匀浆备用。 7.2.4 其他海参制品 直接粉碎、匀浆或混匀,备用。 7.3 海参皂苷的提取 7.3.1 固体样品 粉末状试样称取约2g(精确至0.01g),匀浆试样称取约10g(精确至0.01g),加入40mL乙醇溶 液(5.13),回流提取1h,重复提取3次,合并乙醇提取液于鸡心瓶中,50℃旋转蒸发除去乙醇,提取物 用20mL水溶解,加入20mL正丁醇,充分振荡,静置分层,吸取上层正丁醇层,按上述方法用正丁醇重 复萃取3次,合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中,50℃旋转蒸发至干,即得海参皂苷粗提物。 7.3.2 液体样品 准确移取20mL~50mL样品于分液漏斗中,加入等体积正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液于鸡 心瓶中,50℃旋转蒸发至干,即得海参皂苷粗提物。 7.4 水解 将7.3得到的粗提物溶解于2mL三氟乙酸溶液(5.15)后,转移至5mL安瓿瓶中,充氮封管, 120℃水解2h,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(5.16)中和至pH值为6.5~7.5后转移入10mL具塞试 管中,加1mL三氯甲烷,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氯甲烷层,按上述方法重复萃取3次,将上层 水相转移至5mL容量瓶中,用水定容至5mL,即得海参皂苷水解液。 7.5 衍生及净化 7.5.1 衍生 准确移取7.4制备的试样海参皂苷水解液250μL于15mL反应管中,加入250μLPMP衍生剂溶 液(5.18)和250μL的NaOH溶液(5.17),涡旋混合混匀,70℃水浴反应30min,取出冷却至室温,加 250μL盐酸溶液(5.14),涡旋混合。 7.5.2 净化 加1mL三氯甲烷,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氯甲烷层,按上述方法用三氯甲烷重复萃取 3次。将上层水相过0.45μm滤膜,供高效液相色谱分析。 3GB/T33108—2016 7.6 标准工作曲线制作 准确移取浓度为6.48mg/L,12.96mg/L,19.44mg/L,25.92mg/L,32.4mg/L的喹诺糖标准工作 液(5.20)250μL于15mL具塞反应管中,加入250μLPMP衍生剂溶液(5.18)和250μL的氢氧化钠溶 液(5.17),涡旋混合混匀后,70℃水浴反应30min,取出冷却至室温,加250μL盐酸溶液(5.14),涡旋 混合。 加1mL三氯甲烷,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氯甲烷层,按上述方法用三氯甲烷重复萃取 3次。将上层水相过0.45μm滤膜。以喹诺糖标准工作溶液浓度为横坐标,以喹诺糖衍生物峰面积为 纵坐标绘制标准工作曲线。 7.7 空白试验 除不加试样外,均按上述测定条件和步骤进行。 7.8 平行试验 对同一试样进行平行试验测定。 7.9 测定 7.9.1 液相色谱参考条件 7.9.1.1 色谱柱:C18柱,150mm×4.6mm,5μm或其他性能相当者。 7.9.1.2 柱温:25℃。 7.9.1.3 检测波长:250nm。 7.9.1.4 进样量:20μL。 7.9.1.5 流速:1.0mL/min。 7.9.1.6 流动相:磷酸盐-乙腈溶液(5.22)。 7.9.2 色谱分析 分别注入20μL喹诺糖系列标准衍生液(7.6)、试样衍生液(7.5)和空白衍生液(7.7)于高效液相色 谱仪中,按7.9.1规定的色谱条件进行分析,记录峰面积,试样液中喹诺糖衍生物的响应值均应在标准 曲线范围之内。根据标准品的保留时间定性,外标法定量。喹诺糖标准溶液衍生物和试样液衍生物液 相色谱图参见附录A。 7.10 结果计算与表述 7.10.1 试样中海参皂苷的含量(以喹诺糖计)按式(1)计算: X=(c1-c0)×5 m…………………………(1) 式中: X———试样中海参皂苷的含量(以喹诺糖计),单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L); c1———试样海参皂苷水解液中喹诺糖的浓度,单位为