ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33114—2016 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPrunusnecroticringspotvirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、福建省农业 科学院。 本标准主要起草人:张永江、黄迎波、孔君、谢丽雪、李桂芬、马洁、辛言言、魏梅生。 ⅠGB/T33114—2016 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus)的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带李属坏死环斑病毒的植物及其产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964 植物病毒检测规范 SN/T3457 植物病毒分子生物学检测规范 3 李属坏死环斑病毒基本信息 学名:Prunusnecroticringspotvirus 缩写:PNRSV 分类地位:雀麦花叶病毒科(Bromoviridae),等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)。 李属坏死环斑病毒其他信息参见附录A。 4 方法原理 李属坏死环斑病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据PNRSV与抗体之 间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA);依据PNRSV的基因 组特征建立RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测方法;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有 PNRSV。 5 仪器、用具及试剂 5.1 仪器 电子天平(感量0.001g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(-80℃)、制 冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪。 5.2 用具 酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、Eppendorf 管、研钵、微型磨杵等。 1GB/T33114—2016 5.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D。 6 抽样和样品制备 6.1 抽样 有病毒为害症状的植物材料单独抽样,PNRSV的为害症状描述参见附录A;无症状的种子、苗木 及其产品抽样方法按照SN/T2122中规定执行。 6.2 样品制备 样品制备参照SN/T2964和SN/T3457规定执行。 苗木及其组培苗等产品:有明显症状的,直接取有症状叶片1g单独制样,用于后续检测;无明显症 状的,可5株叶片混合采样用于后续检测。 7 检测鉴定 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 把制备的样品上清液加入已包被PNRSV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平 行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照,感染PNRSV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓 冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见 附录B。 7.2 RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C。 7.3 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D。如采用商品化一 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。 8 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行: ———首先采用DAS-ELISA进行初步筛检。 ———若检测结果为阳性,采用RT-PCR方法进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带 PNRSV。若验证结果为阴性,则采用实时荧光RT-PCR进行进一步验证。若进一步验证的 结果为阴性,则判定样品不携带PNRSV;若进一步验证的结果为阳性,则判定样品携带 PNRSV。 ———若检测结果为阴性,采用RT-PCR方法进行验证,若验证结果为阴性,则判定样品不携带 2GB/T33114—2016 PNRSV;若RT-PCR验证结果为阳性,则需要将PCR产物进行测序,序列结果相符则判定样 品携带PNRSV。 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带PNRSV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种苗、叶片等样品保存在 -80℃冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年。 9.2 结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片和测序结果;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图。 3GB/T33114—2016 附 录 A (资料性附录) 李属坏死环斑病毒相关资料 A.1 寄主范围 该病毒寄主范围广泛,自然和实验接种侵染21科双子叶植物,该病毒可侵染大多数李属植物,如: 李(Prunusdomestrica)、杏(P.armeniaca)、桃(P.persica)、樱桃李(P.cerasifera)、欧洲酸樱桃(P. cerasua)、欧洲甜樱桃(P.avium)、马哈利酸樱桃(P.mahaleb)、稠李(P.padus)、油桃(P.persicavar. nectarina)、野黑樱(P.serotina)、黑刺李(P.spinosa)等;该病毒可侵染玫瑰(Rosarugosa)、啤酒花 (Humuluslupulus)等。在人工接种的情况下还可侵染180余种植物。 A.2 为害症状 病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状,仅仅在接种指 示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染;一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑 和孔洞,但在以后的年份里,在叶子和果实上很少出现症状;另一些分离物在侵染当年产生坏死反应,随 后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟,水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现 了无症状到严重皱缩花叶症状,包括叶子上的褪绿点、叶扭曲,水果延迟成熟。在玫瑰上无症状侵染很 普遍,症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更多不成形的花,被侵染的植株通常无活力。在啤酒花 上产生褪绿线和环斑。 A.3 分布地区 广泛分布在温带地区,如欧洲各国和美国都有发生。 A.4 传播方式 机械接种传播、花粉传播、种子传播,也可通过无性繁殖苗木、组培苗等的运输人为途径进行长距离 传播。 A.5 粒体形态 李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体,直径23nm~27nm,有些粒体为准等轴球状到短棒状 (轴比为1.01~1.5);有些株系的病毒粒体呈明显的棒状(轴比大于2.2);有些棒状粒体达70nm。棒状 粒体的有无及比例因株系而异。 A.6 基因组 正单链RNA,3分体基因组,RNA-1长3.662kb,RNA-2长2.507kb,RNA-3长1.887kb。 4GB/T33114—2016 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的李属坏死环斑病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。 B.1.4 1×PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15g 氯化钾(KCl) 0.2g 吐温-20(Tween-20) 0.5mL 溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。 B.1.5 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000) 20.0g 溶于900mL的1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。 B.1.6 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 溶于900mL灭菌双蒸水中,并定容至1000mL,4℃储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) 牛血清白蛋白(BSA) 2.0g 5GB/T33114—2016 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000~40000) 20.0g 溶于900mL1×PBST中,并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。 B.1.8 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺 97mL 氯化镁(MgCl2) 0.1g 溶于800mL灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH值至9.8,定容至