ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33116—2016 琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofAcustadespecta(Gray,1839) 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫 局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中国科学院动物研究所。 本标准主要起草人:周卫川、王沛、崔俊霞、吴志毅、肖琼、陈德牛。 ⅠGB/T33116—2016 琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了琉球球壳蜗牛Acustadespecta(Gray,1839)的检疫鉴定方法。 本标准适用于琉球球壳蜗牛的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T3067 软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 膜厣 epiphragm 蜗牛分泌的一种与壳口同样大小和形状的乳白色不透明黏液膜,用以封闭壳口。 3.2 阴茎 penis 蜗牛雄性生殖器官。 注:阴茎系统一般由阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌和鞭状体组成。 3.3 矢囊 dartsack 蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构。 3.4 恋矢 lovedart 矢囊中钙质或壳质的骨针,为蜗牛交配时刺激器官。 注:恋矢的质地和形状常用于分类。 3.5 受精囊 bursacopulatrix 蜗牛的受精器官,由受精囊和受精囊柄组成。 注:其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定。 4 基本信息 学名:Acustadespecta(Gray,1839),其亚种有:A.despectadespecta(Gray,1839);A.despecta praetenuis(Pilsbry&Hirase,1904);A.despectasieboldiana(Pfeiffer,1850)。 异名:HelixdespectaGray,1839;A.despectaSowerby,1839;EulotasieboldianaPfeiffer,1905; 1GB/T33116—2016 EulotakikaiensisPilsbry,1902;A.despectaikiensis(Pilsbry&Hirase,1904);A.despectakikaiensis (Pilsbry,1902)。 英文名:Ryukyuroundsnail;Koreanroundsnail。 分类地位:琉球球壳蜗牛A.despecta(Gray,1839),在分类上属于软体动物门Mollusca,腹足纲 Gastropoda,柄眼目Stylommatophora,巴蜗牛科Bradybaenidae,球壳蜗牛属AcustaAlbers,1860。琉 球球壳蜗牛的近似种有灰球壳蜗牛A.ravida(Benson,1842)、红粉缘球壳蜗牛A.tourannensis(Sou- leyet,1842)。 5 方法原理 琉球球壳蜗牛昼伏夜出,常隐藏在人们难以发现的地方,易于传播。其传播特点是不需要特定的寄 主,凡接触过地面的物品都可传播。传播方式和途径是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态、软体解剖 和分子特征是实验室鉴定的主要依据。 6 器具和试剂 6.1 器具 体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷 盘、培养皿、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖蜡盘、标签、移液枪、微型离心机、PCR仪、 1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、恒温金属浴。 6.2 试剂 75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR反应液、ddH2O。 7 现场检测 对来自疫区(参见附录A)的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输工具、废塑料、木质包装 箱、苗木、水果、蔬菜、花卉、未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着其上,琉球球壳蜗牛昼伏夜出,尤 其要注意阴暗蔽光处的检查,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹。琉球球壳蜗牛爬行过后,会留下银灰色的 丝带状黏液痕迹,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛标本,随时装入塑料自封袋或标本 瓶,带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有 卵或幼螺。 8 实验室鉴定 8.1 测量观察和软体解剖 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和 螺的形态特征。 将闷杀(见10.1)处理后的标本,参照SN/T3067解剖软体,分离出生殖系统。 2GB/T33116—2016 8.2 球蜗牛属AcustaAlbers,1860鉴定特征 贝壳圆球形,有脐孔,体螺层特大,膨胀,胚螺层常光滑,口缘呈椭圆形,口唇简单,锋利。阴道上的 矢囊十分长,恋矢石灰质,无鞭状体。 8.3 琉球球壳蜗牛A.despecta(Gray,1839)鉴定特征 8.3.1 卵 卵粒圆形,白色,直径2.0mm左右。 8.3.2 贝壳 8.3.2.1 成螺 贝壳中等大小,壳质薄,但坚固,呈圆球形。有5个~6个螺层,前几个螺层均匀增长,略凸出,螺旋 部低矮,呈矮圆锥形。体螺层增长迅速,下部特别膨大,呈弧形。壳顶钝,缝合线深。壳面为褐黄色或淡 褐色或赤褐色,具有细致而稠密的生长线和较粗的皱纹。壳口宽大圆形,口缘简单,不外折,锋利,内唇 贴覆于体螺层上形成细薄的淡白色胼胝部,轴缘外折,略遮盖脐孔。脐孔狭小,呈孔穴状。壳高 17.5mm~21.0mm,壳宽21.0mm~23.0mm。参见附录B中图B.1。 本种有三个亚种:琉球球壳蜗牛指名亚种A.despectadespecta(Gray,1839);锡伯琉球球壳蜗牛 A.despectasieboldiana(Pfeiffer,1850);镶边琉球球壳蜗牛A.despectapraetenuis(Pilsbry& Hirase,1904)。各亚种之间在形态上基本一致,略有微小差异。参见附录C中表C.1。 8.3.2.2 幼螺 幼螺贝壳较小,壳质薄,透明,易碎,形态特征与成螺贝壳基本一致。 8.3.3 螺体 动物软体多为淡灰色到茶色,螺体色泽变化较大,一般透过贝壳可以看到动物外套膜的形态。触角 颜色明显比腹足为深。参见图B.2。 8.3.4 生殖系统 输卵管短、粗大。阴道有部分插入到矢囊,远端稍呈球形到扁球形。副矢囊被压扁成弧状,中间有 两枝黏液腺,分叉成葡萄状。输精管和阴茎本体之间的界限不明显。阴茎牵引肌的基部稍变粗。阴茎 鞘明显比阴茎牵引肌肥厚,粗细均匀。受精囊顶部稍肥厚,其后逐渐变细。受精囊呈小乳头状。参 见图B.3。 8.3.5 COI基因序列鉴定 按附录D方法提取DNA、PCR扩增和双向测序,将所测序列与已知琉球球壳蜗牛的COI基因序 列(Genbank登录号为AB852623.1)进行比对,相似度一般应≥92%。参见附录D。 9 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据,螺体和生殖系统解剖形态为辅助鉴定特征,并注意与近似种鉴别(参 见表C.2),符合8.3.2或同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4形态特征的蜗牛鉴定为琉球球壳蜗牛A.despecta (Gray,1939)。单独查获的卵粒符合8.3.1形态特征,应通过孵化和饲养实验(参见SN/T3067),做进 3GB/T33116—2016 一步的鉴定。符合8.3.5作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证。 10 标本处理和保存 10.1 标本处理 将蜗牛置于盛满水的瓶中,盖上瓶盖,进行闷杀,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中,逐渐伸展身体;或 逐渐加入少量硫酸镁,进行麻醉闷杀。 将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡1d~2d,然后在75%乙醇溶液中固定,每隔1d~ 2d换1次乙醇溶液,共换3次~4次,便可长期保存于75%乙醇溶液中。 10.2 标本保存 经处理后的标本,至少妥善保存6个月,并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。 4GB/T33116—2016 附 录 A (资料性附录) 琉球球壳蜗牛寄主、地理分布及其他信息 A.1 寄主植物 杂食性,以各种绿色植物为食。幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的 茎、叶和果实,喜食蔬菜和花卉等园艺作物。 A.2 地理分布 日本、朝鲜、缅甸、东帝汶、前苏联、美国(关岛)、中国(台湾)。 A.3 生物学习性与危害性 琉球球壳蜗牛Acustadespecta(Gray,1939)是我国颁布的进境植物检疫性有害生物。该蜗牛有 明显的夏眠和冬眠习性,常以蜡状膜厣封闭壳口越冬越夏。当环境条件不利时,尽管不在休眠季节,该 螺也会分泌黏液形成白色的膜厣封住壳口,以抵御外界不良环境,该蜗牛的这一习性决定了它可在无水 分和食物的情况下长时间远距离传播。琉球球壳蜗牛是一种重要的农业、园艺有害生物,常危害粮、棉、 麻、蔬菜、豆类等农作物以及桑、果树、花卉、烟草等经济作物。该蜗牛不但直接危害作物,而且蜗牛爬行 过后留下的白色黏液痕迹,大大降低了水果蔬菜的商品价值,同时该蜗牛可传播人畜共患寄生虫病,影 响