ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 42117—2022 羊泰勒虫病诊断技术 Diagnostic techniques for ovine Theileria infection 2022-12-30发布 2023-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 42117—2022 前言 本文件按照GB/T1.12020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本文件主要起草人：殷宏、刘军龙、关贵全、李有全、罗建勋。 I GB/T 42117—2022 羊泰勒虫病诊断技术 1范围 本文件规定了羊泰勒虫病的临床诊断和综合判定的技术要求，描述了羊泰勒虫病病原（吕氏泰勒虫 和尤氏泰勒虫)血涂片显微镜检测和聚合酶链式反应检测方法。 本文件适用于羊泰勒虫病病原检测、泰勒虫隐性感染及临床病例的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T 6682 分析试验用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline) PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) TAE：核酸电泳缓冲液（Tris-Acetic acid-EDTA) 5 生物安全要求 样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应符合GB19489的相关规定。 6 临床诊断 6.1 典型临床症状 6.1.1动物精神沉郁，体温升高至40℃～42℃，呈稽留热 6.1.2眼结膜充血肿胀，贫血或可视黏膜黄染 6.1.3肩前和股前淋巴结肿胀，质地坚硬，触诊敏感。 6.1.4消瘦、贫血，尿色淡黄或深黄，但无血尿 1 GB/T 42117—2022 6.2 典型病理变化 6.2.1 动物户体消瘦，血液稀薄、凝固不良。 6.2.2 皮下有胶冻样浸润，黄染及点状出血。 6.2.3 肠系膜不同程度黄染，肠道出血坏死（见附录A中的A.1）。 6.2.4 全身淋巴结不同程度肿大，切面呈灰黄色，髓质有出血点。 6.2.5 胃浆膜、黏膜出血，黏膜有黄白色或暗红色结节（见A.2）。 6.2.6 肝脏、脾脏肿大，被膜有出血点，髓质变软呈紫黑色。 6.3 流行特点 6.3.1 多发于4月～9月，流行于青海血蜱和长角血蜱（见附录B)分布区域 6.3.2 患病动物体表可见蜱或有蜱叮咬史。 6.3.3 羔羊和外地引进羊多发；本地羊症状较轻，引进羊或改良羊常出现明显的临床症状。 6.4 结果判定 病畜出现典型临床症状（6.1）和典型病理变化（6.2），并符合流行特点（6.3），可判为疑似羊泰勒 虫病。 7血涂片显微镜检测 7.1试剂 7.1.1姬姆萨(Giemsa)染色液储存液，按照附录C中C.1配制。 7.1.2 姬姆萨染色液工作液，按照C.2配制。 7.1.3甲醇。 7.1.4香柏油。 7.2 2耗材 7.2.1剪毛剪。 7.2.2载玻片。 7.3仪器 光学显微镜。 7.4 血涂片制备 用剪毛剪剪除羊耳尖毛，针头刺破耳尖，取耳尖静脉血滴于玻片上，用推片推成有末梢的薄血涂片， 并迅速晾干。 7.5 血涂片固定 加甲醇于血涂片上，确保甲醇液体能够覆盖玻片上的红细胞，自然晾干后重复一次。 7.6 血涂片染色 残留的染色颗粒，吹风机吹干或自然晾干后待检 GB/T 42117—2022 7.7显微镜检查 7.8 结果判定 7.8.1 阳性：红细胞内观察到符合附录D的泰勒虫典型虫体时，可确诊。 注：泰勒虫典型虫体主要为梨籽形、圆形、卵圆形和针形，染色后，虫体细胞浆呈浅蓝色，细胞核为紫色 7.8.2疑似：红细胞内未见典型泰勒虫虫体，仅观察到少量点状或不规则形颗粒，判定为疑似感染。 7.8.3阴性：未出现7.8.1和7.8.2的结果，判定为血涂片检测阴性。 8PCR检测方法 SAC 8.1i 试剂与材料 除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。 8.1.1商品化全血基因组提取试剂盒。 8.1.22XPremixTaq酶混合液（商用），包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物。 8.1.3无RNase水 8.1.4琼脂糖（电泳级）。 8.1.5 1XTAE缓冲液，按照C.3配制。 8.1.610mg/mL溴化乙锭（EB），按照C.4配制，或同类核酸染料。 8.1.7无菌滤芯吸头（10μL、200μL、1000μL）。 8.1.8DNA分子量标准品。 8.1.9 PCR 管(0.2 mL)。 8.1.10 ）引物及引物配制： 吕氏泰勒虫上游引物，T1u-F：5'-GGTAGGGTATTGGCCTACTGA-3 吕氏泰勒虫下游引物，Tlu-R：5'-TCATCCGGATAATACAAGT-3 尤氏泰勒虫上游引物，Tui-F：5'-GGTAGGGTATTGGCCTACCGG-3 尤氏泰勒虫下游引物，Tui-R：5'-ACACTCGGAAAATGCAAGCA-3 引物用无RNase水稀释至10μM备用。 时，采血并提取全血总DNA，稀释至1ng/μL作为吕氏泰勒虫阳性对照或按照附录E制备质粒作为阳 性对照。 8.1.12尤氏泰勒虫阳性对照：筛选梨形虫阴性羊，用尤氏泰勒虫感染，当红细胞染虫率达到5%以上 时，采血并提取全血总DNA，稀释至1ng/μL作为尤氏泰勒虫阳性对照或按照附录E制备质粒作为阳 性对照。 8.1.13阴性对照：筛选泰勒虫阴性羊，采集颈静脉血，提取全血总DNA，稀释至1ng/μL作为阴性 对照。 8.2仪器设备 8.2.1PCR扩增仪。 8.2.2高速冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）。 8.2.3生物安全柜。 8.2.4 一20℃冰箱 3 GB/T 42117—2022 8.2.5电泳仪。 8.2.6水平电泳槽。 8.2.7凝胶成像仪。 (000～ 00 00～ 02～ ～ )88 8.3 样品采集 采集待检羊颈静脉血液至含抗凝剂的采血管中，样品采集后可立即用全血基因组提取试剂盒提取 DNA，或保存于2℃～8℃，但不应超过48h。如需长期保存，可将血液样品分装后一20℃保存，避免 反复冻融， 8.4DNA制备 SAG 在样本制备区提取基因组DNA。 采用商品化的全血基因组提取试剂盒提取DNA，提取步骤按照说明书进行。提取好的DNA立即 进行PCR扩增或一20℃保存。 8.5PCR反应体系及条件 8.5.1基本要求 8.5.2吕氏泰勒虫PCR检测反应体系及条件 PCR反应体系如下： 12.5 μL的 2×Premix Taq; -lμL10μmol/L的Tlu-F引物; 一1μL1o μmol/L的Tlu-R引物; 2μL的模板DNA； 8.5μL的无RNase水。 瞬时离心后，置PCR扩增仪内进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退 火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。 8.5.3尤氏泰勒虫PCR检测反应体系及条件 按照下列方法配制25μLPCR体系： 12.5μL的2XPremix Taq; 1μL10 μmol/L的Tui-F引物; -1 μL10o μmol/L的Tui-R引物; 2μL的模板DNA； -8.5μL的无RNase水 瞬时离心后，置PCR扩增仪内进行扩增。扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退 火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。 8.6PCR产物琼脂糖凝胶电泳及成像 中进行电泳，凝胶成像分析系统观察结果并拍照， 4 GB/T 42117—2022 8.7结果判定 8.7.1质控标准 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫标准阳性样品均扩增出380bp大小的特异性条带，标准阴性对照无扩增 条带时，判为实验有效。 8.7.2阳性 符合8.7.1的条件下，待检样品在吕氏泰勒虫检测体系中扩增出380bp大小的条带，可判定为吕氏 泰勒虫核酸阳性；待检样品在尤氏泰勒虫检测体系中扩增出380bp大小的条带，可判定为尤氏泰勒虫 核酸阳性。按照附录F给出的PCR检测结果判定标准图进行判定。 8.7.3阴性 未出现380bp大小的条带，可判定为吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫核酸阴性。 9 ，综合判定 9.1阳性 符合6.4，并符合7.8.1或者8.7.2判定为羊泰勒虫病阳性 9.2隐性感染 不符合6.4，但符合7.8.1或者8.7.2判定为羊泰勒虫隐性感染。 9.3 3阴性 不符合6.4，同时符合7.8.3和8.7.3时，判定为羊泰勒虫病阴性。 5