ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T17778—2025 代替GB/T17778—2005 预混合饲料中D-生物素的测定 DeterminationofD-biotininfeedadditivepremix 2025-06-30发布 2026-01-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T17778—2005《预混合饲料中d-生物素的测定》,与GB/T17778—2005相比,除 结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围,增加了检出限和定量限(见第1章,2005年版的第1章); b) 高效液相色谱法中增加了标准溶液保存有效期和标准曲线(见4.2.6、4.2.7、4.2.8); c) 高效液相色谱法中更改了原理、标准储备液浓度、定容体积和计算公式(见4.1、4.2.6、4.5.1、 4.6,2005年版的4.1、4.2.3.1、4.5.1、4.6); d) 分光光度法中增加了标准溶液保存有效期(见5.2.5、5.2.6); e) 分光光度法中更改了溶剂、提取条件、反应体系和测定波长(见5.2、5.5.1、5.5.2,2005年版的 3.2、3.5.1、3.5.2)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:广州汇标检测技术中心、浙江新和成股份有限公司。 本文件主要起草人:郝燕娟、罗群、杨金枢、王智民、施东明、龙志曦、杨雨澄、罗梓峰、沈达荣、 陈晓强、潘浣钰、章益明、权化丽、隋艳梅。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———1999年首次发布为GB/T17778—1999,2005年第一次修订; ———本次为第二次修订。 ⅠGB/T17778—2025 预混合饲料中D-生物素的测定 1 范围 本文件描述了维生素预混合饲料、复合预混合饲料中D-生物素的高效液相色谱和分光光度测定 方法。 本文件适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料中D-生物素的测定。 本文件高效液相色谱法的检出限为1mg/kg,定量限为3mg/kg;分光光度法的检出限为 1.5mg/kg,定量限为5mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 高效液相色谱法 4.1 原理 试样中的D-生物素用水提取,高效液相色谱仪测定,外标法定量。 4.2 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水:GB/T6682,一级。 4.2.2 乙腈:色谱纯。 4.2.3 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。 4.2.4 5mol/L氢氧化钠溶液:称取20g氢氧化钠,加入适量水溶解,冷却至室温,定容至100mL。 4.2.5 0.05%三氟乙酸溶液:量取0.5mL三氟乙酸,用水定容至1000mL,用氢氧化钠溶液(4.2.4)调 节pH至2.5。 4.2.6 标准储备溶液(0.2mg/mL):称取D-生物素(CAS号:58-85-5,纯度不低于98%)标准品10mg (精确至0.01mg)于50mL容量瓶中,加水、超声溶解,用水定容,混匀。于2℃~8℃保存,有效期 3个月。 4.2.7 标准中间溶液(20μg/mL):准确移取D-生物素标准储备溶液(4.2.6)5mL于50mL容量瓶 中,用水稀释至刻度。于2℃~8℃保存,有效期2个月。 1GB/T17778—2025 4.2.8 标准系列溶液:准确移取适量标准中间溶液(4.2.7),用水稀释定容,配制成质量浓度分别为 0μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL标准系列溶液。临用现配。 4.2.9 微孔滤膜:0.45μm,水系。 4.3 仪器设备 4.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管矩阵检测器。 4.3.2 分析天平:精度0.01mg、0.1mg。 4.3.3 超声清洗器。 4.3.4 酸度计。 4.4 样品 按GB/T20195规定制备试样,至少200g,充分混匀,装入密闭容器中,备用。 4.5 试验步骤 4.5.1 试样溶液制备 平行做两份试验。称取维生素预混合饲料试样2g(精确至0.1mg)、复合预混合饲料试样5g(精 确至0.1mg),置于50mL容量瓶中,加入0.1gDTPA(4.2.3),加入30mL水(4.2.1),超声提取 20min,冷却至室温,用水定容(V),用微孔滤膜(4.2.9)过滤,待测。 4.5.2 测定 4.5.2.1 高效液相色谱参考条件 高效液相色谱参考条件如下: a) 色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm;或性能相当者; b) 流动相:三氟乙酸溶液(4.2.5)-乙腈(4.2.2)(85∶15,体积比); c) 流速:1.0mL/min; d) 进样体积:20μL; e) 柱温:30℃; f) 检测波长:210nm。 4.5.2.2 标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取标准系列溶液(4.2.8)和试样溶液(4.5.1)上机测定。D-生物素标准溶 液的液相色谱图见附录A。 4.5.2.3 定性 以保留时间定性,试样溶液中D-生物素保留时间应与标准系列溶液(质量浓度相当)D-生物素的保 留时间一致,其相对偏差在±2.5%之内。 4.5.2.4 定量 以标准系列溶液中的浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其相关系数应不低于 0.99。试样溶液与标准溶液中D-生物素的响应值均应在仪器检测的线性范围内,如超出线性范围,应 将试样溶液(4.5.1)用水稀释后重新测定。单点校准定量时,试样溶液中D-生物素的浓度与标准溶液浓 度相差不超过30%。 2GB/T17778—2025 4.6 试验数据处理 试样中D-生物素的含量,以质量分数w表示,单位为毫克每千克(mg/kg),多点校正按公式(1)计 算,单点校正按公式(2)计算: w=ρ×V×1000 m×1000×f ……………………(1) 式中: ρ ———从标准曲线查得的试样溶液中D-生物素质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); m———试样质量,单位为克(g); V———试样溶液体积,单位为毫升(mL); f———超出标准曲线范围后的稀释倍数; 1000———换算系数。 w=A×ρS×V×1000 AS×m×1000×f ……………………(2) 式中: A ———试样溶液中D-生物素峰面积; ρS———标准溶液中D-生物素质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); AS———标准溶液D-生物素峰面积; m———试样质量,单位为克(g); V———试样提取液的总体积,单位为毫升(mL); f———稀释倍数; 1000———换算系数。 测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字。 4.7 精密度 在重复性条件下,D-生物素含量不小于100mg/kg时两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差 值不大于20%;D-生物素含量小于100mg/kg时两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大 于30%。 5 分光光度法 5.1 原理 试样中D-生物素用无水乙醇提取,在硫酸乙醇溶液中D-生物素和4-二甲基氨基肉桂醛生成橙色 化合物,在一定范围内颜色深浅与D-生物素的含量成正比。 5.2 试剂和材料 警示:强酸应小心操作,取用均应在通风橱中进行。 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 5.2.1 水:GB/T6682,三级。 5.2.2 无水乙醇。 5.2.3 硫酸乙醇溶液:移取2mL硫酸沿壁缓慢加入98mL无水乙醇中,搅拌均匀。2℃~8℃保存。 5.2.4 4-二甲基氨基肉桂醛无水乙醇溶液:称取适量4-二甲基氨基肉桂醛,用无水乙醇(5.2.2)溶解配 制成2g/L的溶液,装入棕色瓶中,-18℃以下保存。 3GB/T17778—2025 5.2.5 标准储备溶液(1mg/mL):称取D-生物素(CAS号:58-85-5,纯度不低于98%)标准品50mg (精确至0.01mg)于50mL容量瓶中,加无水乙醇(5.2.2)超声溶解,定容,混匀。于2℃~8℃保 存,有效期3个月。 5.2.6 标准工作溶液(20μg/mL):移取D-生物素标准储备溶液(5.2.5)1mL于50mL容量瓶中,用无 水乙醇(5.2.2)稀释至刻度,混匀。于2℃~8℃保存,有效期2个月。 5.2.7 快速定性滤纸。 5.3 仪器设备 5.3.1 分光光度计:波长精度±1nm,配1cm比色皿。 5.3.2 分析天平:精度0.01mg、0.1mg。 5.3.3 超声清洗器。 5.4 样品 同4.4。 5.5 试验步骤 5.5.1 试样溶液制备 平行做两份试验。称取维生素预混合饲料2g(精确至0.1mg)、复合预混合饲料5g~10g(精确 至0.1mg),置于50mL容量瓶中,加入30mL无水乙醇(5.2.2)超声20min,冷却至室温,用无水乙醇 (5.2.2)定容,混匀,用滤纸(5.2.7)过滤,备用。 5.5.2 测定 5