中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 ICS 65.120 CCS B 46 GB/T 19540—2025 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 Determination of zearalenone in feeds 2025 ⁃06⁃30 发布 2026 ⁃01⁃01 实施 国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布代替 GB/T 19540—2004 、GB/T 28716—2012GB/T 19540—2025 前　言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规 定起草。 本文件代替 GB/T 19540 —2004《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 》和GB/T 28716 —2012《饲料中玉 米赤霉烯酮的测定　免疫亲和柱净化 ⁃高效液相色谱法 》 。与GB/T 19540 —2004和GB/T 28716 — 2012相比，除结构调整和编辑性改动外 ，主要技术变化如下 ： a）更改了适用范围 （见第 1章，GB/T 19540 —2004和GB/T 28716 —2012的第 1章） ； b）删除了薄层色谱法和酶联免疫吸附测定法 （见GB/T 19540 —2004的第 3章、第4章） ； c）增加了液相色谱 ⁃串联质谱法 （见第 4章） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 （SAC/TC 76）提出并归口 。 本文件起草单位 ：上海市农业科学院 、上海市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人 ：韩铮、曹莹、赵志辉、聂冬霞、郭大凯、王欣艺、吴剑平、杨海锋、郭文博、张婧、 严凤、黄晴雯、范楷、商军、吴雨珊。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——2004年发布为 GB/T 19540 —2004，2012年发布为 GB/T 28716 —2012； ——本次为第一次修订 。 Ⅰ GB/T 19540—2025 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 1　范围 本文件描述了饲料中玉米赤霉烯酮的液相色谱 ⁃串联质谱法和高效液相色谱法 。 本文件适用于配合饲料 、精料补充料 、浓缩饲料和植物性饲料原料中玉米赤霉烯酮的测定 。 本文件的检出限为 2 μg/kg，定量限为 10 μg/kg。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4　液相色谱 ⁃串联质谱法 4.1　原理 试样中的待测物用乙腈溶液提取 ，提取液用磷酸盐缓冲溶液稀释 ，经免疫亲和柱净化 ，用液相色谱 ⁃ 串联质谱仪测定 ，基质匹配标准曲线校准 ，外标法定量 。 4.2　试剂或材料 警示——玉米赤霉烯酮毒性很强 ，操作时注意避免接触皮肤和衣物 ，带上医用乳胶手套 。各种有 机试剂小心操作 ，取用应在通风橱中进行 。 除非另有规定 ，仅使用分析纯试剂 。 4.2.1　水：GB/T 6682，一级。 4.2.2　甲醇：色谱纯。 4.2.3　乙腈：色谱纯。 4.2.4　甲酸：色谱纯。 4.2.5　氯化钠。 4.2.6　氢氧化钠溶液 （0.2 mol/L） ：称取 8.0 g氢氧化钠 ，用水溶解 ，转移至 1 000 mL容量瓶中 ，定容，混匀。 4.2.7　80%乙腈溶液 ：量取 800 mL乙腈（4.2.3）于1 000 mL容量瓶中 ，用水稀释 、定容，混匀。 4.2.8　0.1%甲酸溶液 ：移取 1 mL甲酸（4.2.4）于1 000 mL容量瓶中 ，用水稀释 、定容，混匀。 4.2.9　磷酸盐缓冲溶液 （PBS） ：称取 8.0 g氯化钠、1.16 g磷酸氢二钠 、0.2 g磷酸二氢钾 、0.2 g氯化钾， 用水溶解稀释定容至 1 000 mL，用氢氧化钠溶液 （4.2.6）调节 pH至7.4。 1 GB/T 19540—2025 4.2.10　乙腈 ⁃0.1%甲酸溶液 ：量取 100 mL乙腈（4.2.3）于1 000 mL容量瓶中 ，用0.1%甲酸溶液 （4.2.8）稀释、定容，混匀。 4.2.11　标准储备溶液 （100 μg/mL）：称取玉米赤霉烯酮标准品 （CAS号：17924 ⁃92⁃4，纯度不低于 99.5%）10 mg（精确至 0.01 mg）于100 mL容量瓶中 ，用乙腈（4.2.3）溶解、定容，混匀。-18 ℃以下保 存，有效期 12个月。 4.2.12　标准中间溶液 （10 μg/mL） ：准确移取 5 mL标准储备溶液 （4.2.11）于50 mL容量瓶中 ，用乙腈 （4.2.3）稀释、定容，混匀。-18 ℃以下保存 ，有效期 6个月。 4.2.13　标准系列溶液 ：准确移取适量的标准中间溶液 （4.2.12）于10 mL 容量瓶中 ，用乙腈 ⁃0.1%甲酸 溶液（4.2.10）配制成质量浓度分别为 2 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的标准系 列溶液。临用现配 。 4.2.14　玉米赤霉烯酮免疫亲和柱 ：柱容量 ≥1.5 μg，柱回收率 ≥80%，或性能相当者 。 4.2.15　微孔滤膜 ：0.22 μm，有机系。 4.3　仪器设备 4.3.1　液相色谱 ⁃串联质谱仪 ：配有电喷雾离子源 （ESI） 。 4.3.2　分析天平 ：精度 0.01 g、0.01 mg。 4.3.3　涡旋混合器 。 4.3.4　超声波清洗器 ：功率 ≥250 W。 4.3.5　离心机：转速 ≥10 000 r/min。 4.3.6　氮吹仪：温控范围 30 ℃~ 60 ℃。 4.3.7　固相萃取装置 。 4.4　样品 按GB/T 20195规定制备试样 ，至少 200 g，粉碎使其全部通过 0.425 mm孔径的试验筛 ，混合均 匀，装入密闭容器中 ，备用。选取类型相同 、均匀一致 、且在待测物保留时间处 ，仪器响应值小于方法定 量限 30%的饲料样品 ，作为空白样品 。 4.5　试验步骤 4.5.1　提取 平行做两份试验 。称取试样约 5.0 g（精确至 0.01 g） ，置于 50 mL离心管中 ，准确加入 0.5 g氯化 钠（4.2.5）和25 mL 80%乙腈溶液 （4.2.7），涡旋混合 2 min，在250 W的超声功率下提取 30 min（每 5 min涡旋混合 1次） ，10 000 r/min离心 5 min，移取 5 mL上清液于 50 mL离心管中 ，加入 20 mL PBS （4.2.9） ，超声混匀 ，备用。 4.5.2　净化 准确移取 5 mL样品提取液 （4.5.1） ，调节压力使溶液以不大于 2 mL/min 流速缓慢通过免疫亲和 柱，抽干。颜色较深的提取液 ，先用 10 mL 10%甲醇溶液淋洗 ，再用 10 mL水淋洗；其他提取液以 10 mL水淋洗两次 ，保持流速不大于 2 mL/min ，并抽干。准确加入 1.5 mL甲醇（4.2.2）洗脱，流速不大 于2 mL/min ，收集洗脱液于 40 ℃氮气吹干 ，用1 mL乙腈 ⁃0.1%甲酸溶液 （4.2.10）溶解残渣 ，涡旋混 匀，过微孔滤膜 （4.2.15） ，上机测定 。 2 GB/T 19540—2025 4.5.3　基质匹配标准系列溶液的配制 取基质空白样品 ，按4.5.1和4.5.2处理，得到基质空白溶液 。分别准确移取标准系列溶液 （4.2.13）各1 mL，于40 ℃下氮气吹至近干 ，准确加入 1 mL基质空白溶液 ，涡旋混匀 。配制成质量浓度 分别为 2 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基质匹配标准系列溶液 。临用现配 。 4.5.4　测定 4.5.4.1　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 ： a）色谱柱：C18柱，柱长 150 mm，内径 2.1 mm，粒径 1.8 µm，或性能相当者 ； b）柱温：40 ℃； c）流速：0.4 mL/min ； d）进样量：3 μL； e）流动相：A相为乙腈 （4.2.3） ，B相为 0.1%甲酸溶液 （4.2.8） ，梯度洗脱程序见表 1。 表1　梯度洗脱程序 时间 /min 0 4 5 5.1 8A相/% 10 90 90 10 10B相/% 90 10 10 90 90 4.5.4.2　质谱参考条件 质谱参考条件如下 ： a）电离模式 ：电喷雾电离 ，负离子模式 （ESI-） ； b）检测方式 ：多反应监测 （MRM） ； c）毛细管电压 ：3 kV； d）离子源温度 ：150 ℃； e）雾化器温度 ：500 ℃。 多反应监测 （MRM）离子对及碰撞能量参考值见表 2。 表2　玉米赤霉烯酮特征离子及参考质谱条件 被测物名称 玉米赤霉烯酮 a 定量离子 。母离子 m/z 317.2子离子 m/z 131.1 175.1a锥孔电压 V 66碰撞能量 eV 30 24 3 GB/T 19540—2025 4.5.4.3　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下 ，分别取基质匹配标准系列溶液 （4.5.3）和试样溶液 （4.5.2）上机测定 。基质匹 配标准溶液的定量离子色谱图见附录 A中图 A.1。