ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T21107—2025 代替GB/T21107—2007 饲料中马、驴源性成分的测定 Determinationofhorseanddonkey-derivedmaterialsinfeeds 2025-06-30发布 2026-01-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T21107—2007《动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法》,与 GB/T21107—2007相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围和检出限(见第1章,2007年版的第1章); b) 增加了“缩略语”一章(见第4章); c) 增加了“实时荧光聚合酶链式反应法”一章(见第5章); d) 更改了样品(见6.4,2007年版的第7章); e) 更改了结果判定与表述(见6.6,2007年版的第9章); f) 更改了实验室污染防治措施(见第7章,2007年版的第10章); g) 增加了“危害性废弃物处理”一章(见第8章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新希望六和股份有限公司。 本文件主要起草人:蔡一村、潘良文、韩伟、李勇、许镇坚、杨青、张语秋、张晨、邵冰玉、薛俊欣、 林颖峥。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2007年发布的GB/T21107—2007; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T21107—2025 饲料中马、驴源性成分的测定 1 范围 本文件描述了饲料中马、驴源性成分的实时荧光聚合酶链式反应和聚合酶链式反应检测方法。 本文件中实时荧光PCR法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料、复合预混合饲料和 混合型饲料添加剂中马、驴源性成分的定性检测;PCR法适用于动物源性饲料原料中马、驴源性成分的 检测。 本文件的检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 GBT27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) Ct值:循环阈值(cyclethreshold) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethylaminomethane) 5 实时荧光聚合酶链式反应法 5.1 原理 根据马和驴的特异性DNA片段设计引物和探针,采用实时荧光PCR技术进行扩增,根据扩增反 应中产生的荧光信号和Ct值实现对马、驴源性DNA成分的检测。 1GB/T21107—2025 5.2 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。 5.2.1 水:GB/T6682,一级。 5.2.2 2×实时荧光PCR预混液:含有TaqDNA聚合酶、实时荧光PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs等 成分。 5.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取400g氢氧化钠,加水定容至1L。 5.2.4 Tris-盐酸溶液(1mol/L):称取121.1gTris溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容 至1L。在103.4kPa、121℃灭菌20min,室温保存。 5.2.5 EDTA溶液(0.5mol/L):称取186.1gNa2EDTA·2H2O溶解于800mL水中,磁力搅拌器上 剧烈搅拌,加入氢氧化钠约20g,再滴加氢氧化钠溶液(5.2.3)调pH至8.0,定容至1L,在103.4kPa、 121℃灭菌20min,室温保存。 5.2.6 Tris-EDTA(TE)缓冲液:分别量取10mLTris-盐酸溶液(5.2.4)和2mLEDTA溶液(5.2.5),加 水定容至1L,混匀,在103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。 5.2.7 引物和探针:用TE缓冲液(5.2.6)或水将每条引物或者探针分别配制成10μmol/L工作溶 液,备用。-18℃以下分装保存,避免多次冻融。序列见表1。 5.2.8 阳性对照样品:含有马、驴源成分的样品。 5.2.9 阴性对照样品:不含有马、驴源成分但含有其他动物成分的样品。 表1 引物探针序列 目标物种引物探针名称 序列 基因序列号片段大 小/bp 18SrRNA18S-179bp-F 18S-179bp-R 18S-179bp-P5'-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3' 5'-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3' 5'-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3'AF176811.1179 马Horse-125bp-F Horse-125bp-R Horse-125bp-P5'-ACTCATCAAACGCCGCTCTC-3' 5'-GCTGTGAAGACCCCGTTGG-3' 5'-[FAM]-CCAGGGCTCGGTGCTTCCAATCGC-[TAMRA]-3'NC_009171.3125 驴Donkey-95bp-F Donkey-95bp-R Donkey-95bp-P5'-TGAGTCAGGTGCTCCTTGAAC-3' 5'-CTGAGGCACTCGTCTCTCTTG-3' 5'-[FAM]-CCGCTTCCCGTCAGTTGTGTCCTTAGTTG-[TAMRA]-3'NC_052194.195 注:扩增靶标序列见附录A。 5.3 仪器设备 5.3.1 实时荧光PCR仪。 5.3.2 分析天平:精度0.1mg。 5.3.3 离心机:离心速度不低于14000r/min。 5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。 5.3.5 微量移液器:2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等规格。 2GB/T21107—2025 5.4 样品 按照GB/T20195规定制备试样,至少200g,粉碎或碾磨使其全部通过0.25mm孔径的试验筛,充 分混匀,装入密闭容器中,备用。也可采用经过验证等效的其他粉碎和碾磨方法。 同法制备阳性对照样品(5.2.8)和阴性对照样品(5.2.9)。 注:粉碎或研磨一个样品后,清洗粉碎机或研磨仪的容器和刀具,防止污染。 5.5 试验步骤 5.5.1 DNA提取 平行做两份试验。称取试样100mg~200mg,按照GB/T19495.3—2004附录C中C.6.2提取 DNA。也可采用经过验证可靠的DNA提取试剂盒进行DNA提取,具体参照说明书使用。提取空白 对照除不加试样外,其他操作同试样一致。必要时,提取阳性对照样品和阴性对照样品的DNA。 注:提取出的DNA如需保存,置于-18℃以下。 5.5.2 DNA溶液浓度测定 用紫外分光光度计(波长:260nm)或微量核酸蛋白测定仪(5.3.4)测定DNA溶液(5.5.1)的质量浓 度。DNA溶液质量浓度宜控制在5ng/μL~50ng/μL。 5.5.3 对照设置 实时荧光检测过程中应设置阳性对照、阴性对照、扩增空白对照、提取空白对照(5.5.1)。用阳性样 品(5.2.8)的DNA作阳性对照,用阴性样品(5.2.9)的DNA作阴性对照,用等体积的水代替DNA溶液 作为扩增空白对照。 5.5.4 反应体系 按表2配制实时荧光PCR检测反应体系。 表2 实时荧光PCR检测反应体系 试剂 试剂浓度 体积/μL 2×实时荧光PCR预混液(5.2.2) 2× 12.5 上游引物 10μmol/L 1 下游引物 10μmol/L 1 探针 10μmol/L 0.5 DNA溶液 5ng/μL~50ng/μL 5 水 — 5 注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,其反应缓冲液成分可能不同,具体操作参见产品使用说明书。 5.5.5 实时荧光PCR扩增 按表3反应参数在实时荧光PCR仪上进行扩增,以平行测定的Ct值的平均值作为最终结果。 3GB/T21107—2025 表3 实时荧光PCR反应参数 反应步骤 反应温度 反应时间 循环数 预变性 95℃ 10min 1 热循环95℃ 60℃15s 1min40 注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,对PCR反应程序的设置(如:变性温度)可能不同,具体操作参见产品 使用说明书。 5.6 质量控制 5.6.1 内参对照基因扩增 真核生物内参对照基因18SrRNA基因检测应符合下列条件,否则重新提取核酸样品: a) 提取空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值; b) 扩增空白对照