中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 ICS 65.120 CCS B 46 GB/T 21542—2025 饲料中恩拉霉素的测定 液相色谱 ⁃串联质谱法 Determination of enramycin in feeds — Liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry 2025 ⁃06⁃30 发布 2026 ⁃01⁃01 实施 国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布代替 GB/T 21542—2008GB/T 21542—2025 前　　言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规 定起草。 本文件代替 GB/T 21542 —2008《饲料中恩拉霉素的测定　微生物学法 》 ，与GB/T 21542 —2008 相比，除结构调整和编辑性改动外 ，主要技术变化如下 ： a）更改了范围 （见第 1章，2008年版的第 1章） ； b）删除了微生物学法 （见2008年版的第 3章~第10章、附录 A） ； c）增加了液相色谱 ⁃串联质谱法 （见第 4章~第10章） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 （SAC/TC 76）提出并归口 。 本文件起草单位 ：上海市动物疫病预防控制中心 、通威农业发展有限公司 、河南省农畜水产品检验 技术研究院 。 本文件主要起草人 ：严凤、曹莹、张凤枰、彭丽、张婧、商军、常守海、黄士新、吴雨珊、潘娟、张晶晶、 黄家莺、聂晓红、吴剑平、卢加文、董鹏、李华玮、张浩然、徐汀、张亦菲。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——2008年首次发布为 GB/T 21542 —2008； ——本次为第一次修订 。 Ⅰ GB/T 21542—2025 饲料中恩拉霉素的测定 液相色谱 ⁃串联质谱法 1　范围 本文件描述了饲料中恩拉霉素的液相色谱 ⁃串联质谱测定方法 。 本文件适用于配合饲料 、浓缩饲料 、精料补充料 、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中恩拉霉 素（以恩拉霉素 A和恩拉霉素 B之和计）的测定。 本文件恩拉霉素 A和恩拉霉素 B的检出限均为 0.05 mg/kg，定量限均为 0.10 mg/kg。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4　原理 试样中待测物用盐酸甲醇溶液或甲酸甲醇溶液提取 ，固相萃取柱净化 ，液相色谱 ⁃串联质谱法测 定，基质匹配外标法定量 。 5　试剂或材料 除非另有规定 ，仅使用分析纯试剂 。 5.1　水：GB/T 6682，一级。 5.2　甲醇：色谱纯。 5.3　甲酸：色谱纯。 5.4　乙酸乙酯 。 5.5　盐酸溶液 （0.1 mol/L） ：取盐酸 4.2 mL，用水稀释至 500 mL，混匀。 5.6　盐酸甲醇溶液 ：移取甲醇 55 mL与盐酸溶液 （5.5）45 mL，混匀。 5.7　2%甲酸甲醇溶液 ：移取甲酸 2 mL，用甲醇稀释至 100 mL，混匀。 5.8　5%氨水溶液 ：移取氨水 5 mL，用水稀释至 100 mL，混匀。 5.9　甲醇氨水溶液 ：移取甲醇 20 mL与5%氨水（5.8）80 mL，混匀。 5.10　1%甲酸乙酸乙酯 ：移取甲酸 1 mL，用乙酸乙酯稀释至 100 mL，超声混匀 。 1 GB/T 21542—2025 5.11　盐酸甲醇溶液 （0.1 mol/L） ：移取盐酸 1 mL，用甲醇稀释至 120 mL，混匀。 5.12　0.1%甲酸溶液 ：移取甲酸 （5.3）0.5 mL，用水稀释至 500 mL，混匀。 5.13　复溶液 ：移取甲醇 （5.2）80 mL与0.1%甲酸溶液 （5.12）20 mL，混匀。 5.14　标准储备溶液 （1 mg/mL） ：准确称取恩拉霉素 A（CAS：34438 ⁃27⁃2，纯度不低于 95%）和恩拉霉 素B（CAS：34304 ⁃21⁃7，纯度不低于 83%）标准品各适量 （折算成有效成分 5 mg，精确至 0.01 mg）分别 于5 mL容量瓶中 ，用甲醇（5.2）溶解定容 。-18 ℃以下保存 ，有效期 6个月。 5.15　混合标准中间液 （100 μg/mL）：准确吸取恩拉霉素 A和恩拉霉素 B标准储备溶液各 1 mL于 10 mL容量瓶中 ，用甲醇（5.2）定容，混匀。-18 ℃以下保存 ，有效期 6个月。 5.16　混合标准系列溶液 Ⅰ：精密量取适量混合标准中间液 （5.15） ，用复溶液 （5.13）稀释，配制成质量 浓度分别为 2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的混合标准系列溶液 Ⅰ。 5.17　混合标准系列溶液 Ⅱ：精密量取适量混合标准中间液 （5.15） ，用2%甲酸甲醇 （5.7）稀释，配制成 质量浓度分别为 40 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL 的混合 标准系列溶液 Ⅱ。 5.18　固相萃取柱 A：填料为改性苯乙烯 ⁃二乙烯基苯聚合物 ，200 mg/ 3 mL，或性能相当者 。 5.19　固相萃取柱 B：填料为极性脲基改性苯乙烯 ⁃二乙烯基苯共聚物 ，200 mg/ 6 mL，或性能相当者 。 5.20　微孔滤膜 ：0.22 μm，有机系。 6　仪器设备 6.1　液相色谱 ⁃串联质谱仪 ：配有电喷雾离子源 。 6.2　分析天平 ：精度 0.01 g和0.01 mg。 6.3　离心机 ：转速不低于 10 000 r/min。 6.4　涡旋振荡器 。 6.5　涡旋混合器 。 6.6　固相萃取装置 。 6.7　超声波清洗器 。 6.8　氮吹仪 。 7　样品 按GB/T 20195制备样品 ，至少约 200 g，粉碎使其全部通过 0.425 mm孔径的试验筛 ，充分混匀 ， 装入密闭容器中 ，备用。选取类型相同 ，均匀一致 、且在待测物保留时间处 ，仪器响应值小于方法定量 限30%的饲料样品 ，作为空白样品 。 8　试验步骤 8.1　提取 8.1.1　配合饲料 、浓缩饲料和精料补充料 平行做两份试验 。称取试样 2 g（精确至 0.01 g）于50 mL离心管中 ，准确加入盐酸甲醇溶液 （5.6） 20 mL，涡旋混匀 ，超声提取 30 min，涡旋振荡 10 min，10 000 r/min离心 5 min。准确移取 1 mL上清 液，加入盐酸溶液 （5.5）10 mL，涡旋混匀 ，备用。 2 GB/T 21542—2025 8.1.2　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 平行做两份试验 。称取试样 2 g（精确至 0.01 g）于50 mL离心管中 ，准确加入 2%甲酸甲醇溶液 （5.7）20 mL，涡旋混匀 ，超声 30 min，涡旋振荡 10 min，10 000 r/min离心 5 min，上清液备用 。 8.2　净化 8.2.1　配合饲料 、浓缩饲料和精料补充料 依次用甲醇 5 mL、水5mL活化固相萃取柱 A（5.18） ，将全部备用液 （8.1.1）过柱，待溶液全部流出 之后，用甲醇氨水溶液 （5.9）5 mL淋洗，抽干 1 min，再用 1%甲酸乙酸乙酯 （5.10）5 mL淋洗，抽干 2 min。用盐酸甲醇溶液 （5.11）6 mL洗脱，抽干 1 min，洗脱液于 40 ℃下氮气吹干 ，准确加入 1 mL复溶 液（5.13） ，超声 1 min，涡旋混匀 ，过微孔滤膜 （5.20）后待测。 8.2.2　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 移取 2 mL备用液（8.1.2）通过固相萃取柱 B（5.19） ，收集流出液 ，涡旋混匀 ，过微孔滤膜 （5.20） ，待测。 8.3　基质匹配标准系列溶液的制备 8.3.1　配合饲料 、浓缩饲料和精料补充料 取空白试样 ，按8.1和8.2处理至氮气吹干 ，准确移取混合标准系列溶液 Ⅰ（5.16）各1 mL溶解残 余物，配制成质量浓度分别为 2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基质 匹配标准系列溶液 Ⅰ。 8.3.2　添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂 取空白试样 ，按8.1和8.2处理得到空白基质溶液 ，准确移取混合标准系列工作液 Ⅱ（5.17）各 50 μL，加空白基质溶液稀释至 1 mL，配制成质量浓度分别为 2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、 100 ng/mL、200 ng/mL的基质匹配标准系列溶液 Ⅱ。 8.4　测定 8.4.1　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 ： a）色谱柱：C18柱，柱长 100 mm，内径 2.1 mm，粒径 1.8 µm，或性能相当者 ； b）柱温：35 ℃； c）流速：0.3 mL/min ； d）进样量：5 μL； e）流动相：A相为 0.1%甲酸溶液 （5.12） ，B相为甲醇 （5.2） ，梯度洗脱程序见表 1。 表1　梯度洗脱程序 0