中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 ICS 65.120 CCS B 46 GB/T 21995—2025 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱 ⁃串联质谱法 Determnation of nitroimidazoles in feeds — Liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry 2025 ⁃06⁃30 发布 2026 ⁃01⁃01 实施 国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布代替 GB/T 21995—2008GB/T 21995—2025 前　言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规 定起草。 本文件代替 GB/T 21995 —2008《饲料中硝基咪唑类药物的测定　液相色谱 ⁃串联质谱法 》，与 GB/T 21995 —2008相比，除结构调整和编辑性改动外 ，主要技术变化如下 ： a）适用范围增加了混合型饲料添加剂和异丙硝唑 ，更改了检出限和定量限 （见第 1章，2008年 版的第 1章） ； b）更改了原理 、试剂或材料 、试验步骤 、精密度（见第 4章、第5章、第8章、第10章，2008年版 的第 3章、第4章、第7章、第9章） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 （SAC/TC 76）提出并归口 。 本文件起草单位 ：中国农业大学 、河南省农畜水产品检验技术研究院 。 本文件主要起草人 ：夏曦、吴宁鹏、彭丽、赵亮、孟蕾、黄立、冯晓友、李晓薇、江海洋、沈建忠。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——2008年首次发布为 GB/T 21995 —2008； ——本次为第一次修订 。 Ⅰ GB/T 21995—2025 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱 ⁃串联质谱法 1　范围 本文件描述了饲料中 5种硝基咪唑类药物的液相色谱 ⁃串联质谱测定方法 。 本文件适用于配合饲料 、浓缩饲料 、精料补充料 、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中甲硝 唑、地美硝唑 、洛硝达唑 、异丙硝唑和替硝唑的测定 。 本文件的检出限为 5 μg/kg，定量限为 10 μg/kg。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4　原理 试样中的待测物用乙腈溶液提取 ，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化 ，液相色谱 ⁃串联质谱法测 定，基质匹配标准溶液校准 ，内标法定量 。 5　试剂或材料 除非另有规定 ，仅使用分析纯试剂 。 5.1　水：符合 GB/T 6682中一级的要求 。 5.2　乙腈：色谱纯。 5.3　甲醇：色谱纯。 5.4　丙酮：色谱纯。 5.5　甲酸：色谱纯。 5.6　乙酸：色谱纯。 5.7　5%甲酸甲醇溶液 ：取5 mL甲酸（5.5） ，用甲醇（5.3）稀释至 100 mL，混匀。 5.8　5%氨化甲醇溶液 ：取5 mL氨水，用甲醇（5.3）稀释至 100 mL，混匀。 5.9　0.1%甲酸溶液 ：取100 μL甲酸（5.5） ，用水稀释至 100 mL，混匀。 5.10　0.2%乙酸溶液 ：取1 mL乙酸（5.6） ，用水稀释至 500 mL，混匀。 1 GB/T 21995—2025 5.11　乙腈 ⁃甲醇溶液 ：取400 mL乙腈（5.2） 、100 mL甲醇（5.3）和1 mL乙酸（5.6） ，混匀。 5.12　标准储备溶液 （1 mg/mL） ：称取甲硝唑标准品 （CAS：443⁃48⁃1，纯度 ≥99.5%） 、地美硝唑标准品 （CAS：551⁃92⁃8，纯度 ≥99.8%） 、洛硝达唑标准品 （CAS：7681 ⁃76⁃7，纯度 ≥99.0%） 、异丙硝唑标准品 （CAS：14885 ⁃29⁃1，纯度 ≥99.9%） 、替硝唑标准品 （CAS：19387 ⁃91⁃8，纯度 ≥98.0%）各10 mg（精确至 0.01 mg） ，分别置于 10 mL容量瓶中 ，用甲醇（5.3）溶解并定容 ，混匀。-18 ℃以下保存 ，有效期 3个月。 5.13　混合标准中间溶液 Ⅰ（10 μg/mL） ：准确移取甲硝唑 、地美硝唑 、洛硝达唑 、异丙硝唑 、替硝唑标准 储备溶液 （5.12）各0.1 mL于10 mL容量瓶中 ，用甲醇（5.3）稀释、定容，混匀。-18 ℃以下保存 ，有效 期3个月。 5.14　混合标准中间溶液 Ⅱ（1 μg/mL） ：准确移取混合标准中间溶液 Ⅰ（5.13）1 mL于10 mL容量瓶 中，用甲醇（5.3）定容，混匀。-18 ℃以下保存 ，有效期 3个月。 5.15　内标储备溶液 （0.5 mg/mL） ：称取甲硝唑 ⁃D 3标准品（CAS：83413 ⁃09⁃6，纯度 ≥98.0%） 、地美硝唑 ⁃ D3标准品（CAS：64678 ⁃69⁃9，纯度 ≥98.0%）、洛硝达唑 ⁃ D 3标准品（CAS：1015855 ⁃87⁃4，纯度 ≥ 99.0%） 、异丙硝唑 ⁃D 3标准品（CAS：1015855 ⁃83⁃0，纯度 ≥99.0%） 、替硝唑 ⁃D 5标准品（CAS：1216767 ⁃04⁃2， 纯度 ≥98.0%）各5 mg（精确至 0.01 mg） ，分别置于 10 mL容量瓶中 ，用甲醇（5.3）溶解并定容 ，混匀。 -18 ℃以下保存 ，有效期 3个月。 5.16　混合内标工作溶液 （1 μg/mL） ：准确移取内标储备溶液 （5.12）各20 μL于10 mL容量瓶中 ，用甲 醇（5.3）定容。-18 ℃以下保存 ，有效期 3个月。 5.17　混合标准系列溶液 ：准确移取适量混合标准中间溶液 Ⅰ（5.13） 、混合标准中间溶液 Ⅱ（5.14）和 20 μL混合内标工作溶液 （5.16）于5 mL容量瓶中 ，用0.1%甲酸水溶液 （5.9）定容，配制成质量浓度分 别为 1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL（内标质量浓度均为 4 ng/mL）的 混合标准系列溶液 。临用现配 。 5.18　混合型阳离子交换固相萃取柱 ：150 mg/ 6 mL，或性能相当者 。 5.19　微孔滤膜 ：0.22 μm，水系。 6　仪器设备 6.1　液相色谱 ⁃串联质谱仪 ：配电喷雾离子源 。 6.2　分析天平 ：精度 0.01 mg和0.01 g。 6.3　旋涡混合器 。 6.4　冷冻离心机 ：转速不低于 14 000 r/min。 6.5　固相萃取装置 。 6.6　氮吹仪 。 7　样品 按GB/T 20195制备试样 ，取样品至少 200 g，粉碎使其全部通过 0.425 mm孔径的试验筛 ，充分混 匀，装入密闭容器中 ，备用。选取类型相同 、均匀一致 、且在待测物保留时间处 ，仪器响应值小于方法定 量限 30%的饲料样品 ，作为空白样品 。 2 GB/T 21995—2025 8　试验步骤 8.1　提取 平行做两份试验 。称取试样 2 g（精确至 0.01 g）于50 mL离心管中 ，加入 20 μL混合内标工作溶 液（5.16） ，涡旋混合 30 s，静置 10 min。加入 10 mL乙腈，涡旋混合 5 min，于4 ℃、11 000 r/min离心 5 min，转移上清液于另一离心管 ，残渣加入 10 mL乙腈重复提取一次 。合并两次提取液 ，加入 100 µL 甲酸，涡旋混合 30 s，于4 ℃、11 000 r/min离心 5 min，上清液备用 。 8.2　净化 依次用 5 mL甲醇、5 mL乙腈活化固相萃取柱 ，取4 mL备用液（8.1）过柱，依次用 5 mL丙酮和 5 mL 5%甲酸甲醇溶液 （5.7）淋洗，抽干。用3 mL 5%氨化甲醇溶液 （5.8）洗脱，收集洗脱液 ，30 ℃水 浴氮气吹干 。准确加入 1 mL 0.1%甲酸溶液 （5.9）复溶，4 ℃、14 000 r/min离心 5 min，取上清液过微孔 滤膜（5.19） ，作为试样溶液 ，待测。 8.3　基质匹配标准溶液制备 取空白样品 ，按8.1（不加内标溶液 ）和8.2处理得到氮气吹干后的空白基质 ，分别准确移取 1 mL 混合标准系列工作溶液 （5.17）复溶，配制质量浓度为 1 mg/mL 、2 mg/mL 、10 mg/mL 、20 mg/mL 、 40 mg/mL、100 mg/mL 的基质匹配混合标准系列溶液 。 8.4　测定 8.4.1　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 ： a）色谱柱：C18色谱柱，柱长 100 mm，内径 2.1 mm，粒径 1.7 µm，或性能相当者 ； b）流动相：A相为 0.2%乙酸溶液 （5.10） ，B相为乙腈 ⁃甲醇溶液 （5.11） ，梯度洗脱程序见表 1； c）柱温：40 ℃； d）进样量：5 µL。 表1　梯度洗脱程序 时间 min 0 0.5 1.5 2.5 3.0 3.5 4.0 5.0 5.5 7.0流速 mL/min 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3A % 85 85 6