ICS65.020.30 CCSB43 中华人民共和国国家标准 GB/T45136—2024 猪牛羊体细胞克隆技术规范 Technicalspecificationforsomaticcellcloningofpig,cattle,sheepandgoat 2024-12-31发布 2024-12-31实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、西北农林科技大学、新疆农垦科学院、中国 农业大学、中国标准化研究院。 本文件主要起草人:刘志国、李奎、张涌、王新华、连正兴、张景程、王立民、牟玉莲、邓守龙、敖红、 王冰源、马爱进。 ⅠGB/T45136—2024 猪牛羊体细胞克隆技术规范 1 范围 本文件规定了猪、牛、羊体细胞克隆的要求,描述了相应的证实方法。 本文件适用于猪、牛、羊的体细胞克隆技术操作,其他动物参考使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T24863 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 重构胚 reconstructedembryo 卵母细胞经过去核、注核以及融合操作后,体细胞与去核卵母细胞融合后的胚胎。 3.2 体细胞克隆 somaticcellcloning 体细胞核移植somaticcellnucleartransfer 将一个体细胞(核供体细胞)移植至去核的卵母细胞(受体细胞)中,最终产生一个与核供体细胞个 体遗传物质一致的重构胚(3.1)操作技术。 4 要求 4.1 猪体细胞克隆 4.1.1 猪卵母细胞采集 4.1.1.1 采集前准备 4.1.1.1.1 应在采集当天配制的适量猪卵母细胞成熟培养液并准备成熟培养盘,猪卵母细胞成熟培养 液配方见附录A中A.1。 4.1.1.1.2 成熟培养盘准备好后,应放入细胞培养箱平衡后方可使用。 4.1.1.1.3 生理盐水、冲卵液、培养皿和显微镜载物台恒温板等应预热到38.5℃~39℃。猪冲卵液配 方见A.2。 4.1.1.2 卵泡选择 4.1.1.2.1 应挑选无囊肿、无充血、卵泡直径在3mm~6mm之间的新鲜卵巢,在38.5℃~39℃的生 1GB/T45136—2024 理盐水中保温,并尽快用预热的生理盐水清洗卵巢3次~4次后抽取卵泡液。 4.1.1.2.2 应挑选直径3mm~6mm、卵泡液色泽清亮、无充血、无发黑的卵泡,用抽卵法采集卵泡液。 将采集好的卵泡液收集至离心管中,静置形成沉淀后弃去上清液。加入预热的冲卵液,再次静置形成沉 淀后弃去上清液,反复操作3次~4次。 4.1.1.3 卵丘细胞卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplex,COCs)选择 应挑选形态规则、细胞质均匀而且外围有3层以上卵丘细胞紧密包围的COCs,在冲卵液中清洗 3次~4次后,放入按4.1.1.1.1准备的卵母细胞成熟培养液中洗3次~4次。 4.1.2 猪卵母细胞体外成熟培养 将漂洗后的COCs放入4.1.1.1.1制备的培养盘中,在38.5℃~39℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿 度条件下培养44h~46h。 4.1.3 猪成熟卵母细胞准备 将培养后的COCs转移至离心管中,加入卵丘细胞消化液,反复吹打或者短时振荡脱去卵丘细 胞,然后将其转移至含胚胎操作液的培养皿中,洗掉卵丘细胞。应选择第一极体已经排出、细胞膜完整、 细胞质均匀、卵周隙清晰可见的卵母细胞用于核移植操作。猪卵丘细胞消化液配方见A.3,猪胚胎操作 液配方见A.4。 4.1.4 猪核供体细胞准备 应选择大小均一、细胞形态完整且核型正确的体细胞。体细胞的培养及冻存按照GB/T24863的 规定执行。 4.1.5 猪卵母细胞去核与注核 4.1.5.1 操作盘准备 用含有细胞松弛素的胚胎操作液在培养皿中间制作一条长液滴条,用不含有细胞松弛素的胚胎操 作液在长液滴旁边制作一条短液滴条。液滴条做好后,覆盖矿物油。长液滴条用于放置卵母细胞以及 进行去核、注核操作,短液滴条用于洗针以及放置体细胞。 4.1.5.2 去核与注核 在显微镜下,利用显微操作系统控制持定针和去核注核针进入卵母细胞液滴中,用持定针固定一个 卵母细胞后,用去核注核针吸除极体以及周边部分细胞质。去核操作完成后,用去核注核针吸取一个供 核体细胞,注射至去核卵母细胞的卵周隙中,并用去核注核针轻轻挤压,使体细胞紧贴卵细胞膜。最后 持定针释放卵母细胞,进行下一个卵母细胞的核移植操作。 4.1.5.3 清洗 将注核后的卵母细胞在胚胎操作液中漂洗3次~4次,转移至平衡后的卵母细胞成熟培养液中,置 于细胞培养箱中等待融合。 4.1.6 猪重构胚制备 4.1.6.1 电融合 将待融合的卵母细胞放入胚胎电融合激活液,平衡1min后移至融合槽内,用拨卵针调整位置,应 2GB/T45136—2024 使体细胞与卵母细胞接触面垂直于电流方向后进行电击融合。猪胚胎电融合激活液配方见A.5。 4.1.6.2 激活 将卵母细胞转移至胚胎操作液中,漂洗3次,再转移至猪胚胎培养液-5(Porcinezygotemedium-5, PZM-5)中漂洗3次。放至培养箱培养1h~2h。挑选已融合且细胞膜完整、细胞质状态良好的重构胚 移入预先平衡好的辅助激活液中,放入培养箱培养4h。PZM-5配方见A.6,猪辅助激活液配方见A.7。 4.1.6.3 培养 培养4h后,将重构胚用预热的PZM-5漂洗3次~4次,然后转移至覆盖有石蜡油的PZM-5液滴 中,放入培养箱中,在38.5℃~39℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度条件下培养。 4.2 牛体细胞克隆 4.2.1 牛卵母细胞采集 4.2.1.1 准备成熟培养盘 配制适量牛卵母细胞成熟培养液并制作成熟培养盘,牛卵母细胞成熟培养液配方见附录B中B.1,操 作应符合4.1.1.1给出的细节。 4.2.1.2 卵泡选择 4.2.1.2.1 应选择无囊肿、无充血、无变色发黑且卵泡直径在3mm~8mm之间的新鲜卵巢,其余操作 按4.1.1.2.1的规定执行。 4.2.1.2.2 应选择直径3mm~8mm、卵泡液色泽清亮、无充血、发黑的牛卵泡,卵泡液的采集操作按 4.1.1.2.2的规定执行,牛用改良冲卵液配方见B.2。 4.2.1.3 牛COCs选择 按4.1.1.3的规定执行。 4.2.2 牛卵母细胞体外成熟培养 将漂洗后的COCs放入4.2.1.1制备的培养盘中,在38.5℃~39℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度 条件下培养18h~22h。 4.2.3 牛成熟卵母细胞准备 按4.1.3的规定执行。牛卵丘细胞消化液配方见B.3,牛胚胎操作液配方见B.4。 4.2.4 牛供核体细胞准备 应选择大小均一、细胞形态完整且核型正确的体细胞,在去核注核操作前至少2d进行血清饥 饿,或者在去核注核操作前至少3d进行细胞接触抑制诱导来诱导牛胎儿成纤维细胞进入G0期,消化 后用于注核。 4.2.5 牛卵母细胞去核与注核 按4.1.5的规定执行。 3GB/T45136—2024 4.2.6 牛重构胚制备 4.2.6.1 电融合 牛注核后的卵母细胞宜采用微电极的方法进行融合。融合前,将注核后的卵母细胞放入牛胚胎电 融合液预平衡3min。使用操作臂调整注核后的卵母细胞,使得注入卵母细胞透明带下的体细胞在 3点钟方向,移动微电极到卵母细胞的两端,将电极截面较尖的一端对准注入的体细胞,截面较钝的一 端电极对准另一端,两个电极相互配合夹住卵母细胞,电击融合。重复该操作,直至完成全部卵母细胞 和体细胞的融合。牛胚胎电融合液配方见B.5。 4.2.6.2 激活 将卵母细胞移出融合液,在牛卵母细胞成熟培养液中漂洗3次~4次后,放入培养箱培养1h~2h。 观察体细胞是否融入卵母细胞,记录未融合个数,计算融合率。此时体细胞融入的卵母细胞即为重构 胚。挑出已融合且细胞膜完整的重构胚进行激活,将重构胚用牛胚胎离子霉素激活液漂洗3次~4次 后,放入培养箱培养3min~4min。然后用牛mSOFaa胚胎培养液漂洗3次~4次并放入培养箱培养 3min~4min。之后再将重构胚胎用牛胚胎6-DMAP激活液漂洗3次~4次后,放入牛胚胎6-DMAP 激活液滴中,在培养箱中培养4h~5h。牛mSOFaa胚胎培养液配方见B.6,牛胚胎离子霉素激活液配 方见B.7,牛胚胎6-DMAP激活液配方见B.8。 注:mSOFaa指添加氨基酸的改良型合成输卵管液(Modifiedsyntheticoviductfluidsupplementedwithaminoacids); 6-DMAP指6-(二甲氨基)嘌呤[6-(Dimethylamino)purine]。 4.2.6.3 培养 将激活后重构胚用牛mSOFaa胚胎培养液漂洗3次~4次,再移入覆盖石蜡油的牛mSOFaa胚胎 培养液,放于培养箱中,在38.5℃~39℃、5%(体积分数)CO2、适宜的低氧条件、饱和湿度下培养。 4.3 羊体细胞克隆 4.3.1 羊卵母细胞采集 4.3.1.1 准备成熟培养盘 配制适量羊卵母细胞成熟培养液,配方见附录C中C.1,并制作成熟