ICS65.020.30 CCSB44 中华人民共和国国家标准 GB/T45350—2025 实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP 标记检测法 Laboratoryanimal—Singlenucleotidepolymorphismsmarkermethodsfor inbredmiceandrats 2025-02-28发布 2025-02-28实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)归口。 本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、上海实验动物研究中心、陕西省中医药研究院、山西医 科大学、广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人:魏杰、王洪、岳秉飞、赵莹、李欢、周佳琪、赵丽亚、汤建平、姚养正、宋国华、王静、 范春、陈国强。 ⅠGB/T45350—2025 引 言 0.1 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到6.2近交系大鼠检测(LDR法)与大 鼠SNP位点检测近交系大鼠相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得: 专利持有人姓名:赵莹、汤建平、赵丽亚、聂艳艳、姜珊、范春、陈国强、顾晓雪、沈淼、冯艳。 地址:上海市浦东新区金科路3577号。 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的 责任。 0.2 遗传背景明确是近交系小鼠、大鼠能够应用于生产、检定、研发等各领域的先决条件。为了提升实 验小鼠、大鼠的遗传质量与标准化水平,我国已发布实施了GB/T14927.1《实验动物 近交系小鼠、大 鼠生化标记检测法》和GB/T14927.2《实验动物 近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法》,这两项标准的检 测方法限于蛋白水平,难以实现近交系小鼠、大鼠多品系尤其是亚系的鉴别评价。GB14923《实验动 物 遗传质量控制》推荐了使用分子生物学方法进行遗传质量监测,但没有相应的技术方法。因此,本 文件通过相关SNP标记的测定进行近交系小鼠、大鼠的遗传质量评价,能够更好地提升近交系小鼠、大 鼠的遗传质量,促进其标准化水平和应用价值的提升。 ⅡGB/T45350—2025 实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP 标记检测法 1 范围 本文件描述了实验动物近交系小鼠、大鼠单核苷酸多态性(SNP)标记检测方法及判断标准。 本文件适用于实验动物近交系小鼠、大鼠遗传组成分析、品系鉴别和质量控制。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB14923—2022 实验动物 遗传质量控制 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphisms;SNP 在基因组水平上由单个核苷酸在位置上发生转换、颠换、插入或缺失等引起的DNA序列多态性。 3.2 连接酶检测反应 ligasedetectivereaction;LDR 利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别的方法。 注:高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配,则连 接反应就不能进行。 3.3 纯合性 homozygosity 同源染色体的相对位置上具有相同等位基因的状态。 注:近交系动物通过连续的近亲交配绝大部分的位点都具有纯合性。一个品系内任何个体间进行交配产生的后代 也具有纯合性。 4 试剂与仪器 4.1 试剂 DNA提取试剂盒、PCR反应及产物纯化试剂盒、测序反应试剂盒、琼脂糖。 4.2 实验设备和器材 4.2.1 仪器设备:电泳仪、离心机、PCR仪、紫外凝胶成像系统、遗传分析仪、水浴锅、微波炉、混匀振 荡器。 1GB/T45350—2025 4.2.2 器材:剪刀、镊子、采血管、移液器、离心管、PCR管、琼脂糖制胶板。 5 方法原理 小鼠和大鼠基因组内均存在数量极为丰富的SNP位点。通过筛选品系特异性的SNP标记位 点,并在该位点上下游设计引物,通过PCR扩增、连接酶反应、测序、毛细管电泳等分子生物学方法分 析,得到各近交系的遗传概貌,定期进行遗传质量监测。 6 位点选择 6.1 近交系小鼠检测(直接测序法) 常规近交系小鼠选取表1中前27个SNP标记进行PCR扩增,使用直接测序法进行检测。 除表1前27个标记外,C57BL/6亚系需要加测表1中28号~32号SNP标记,BALB/c亚系需要 加测表1中33号~35号SNP标记。 各实验室可根据自身条件设计或选择引物。表2中引物和退火温度可供参考。 表1 近交系小鼠35个SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点 1 rs3022796 10 rs3023177 19 rs3023382 28 rs3709624 2 rs3022825 11 rs3023203 20 rs3091048 29 rs3659787 3 rs3022883 12 rs3023226 21 rs3091174 30 rs3722313 4 rs3022953 13 rs3089984 22 rs3023436 31 rs3702158 5 rs3022977 14 rs3089109 23 rs3023442 32 rs3724876 6 rs3023034 15 rs3088673 24 rs3023450 33 rs3712692 7 rs3023039 16 rs3023251 25 rs3089349 34 rs3706082 8 rs3023064 17 rs3023342 26 rs3023481 35 rs3656801 9 rs3023162 18 rs3023381 27 rs3089604 — — 表2 近交系小鼠35个SNP引物及退火温度 序号 引物 引物序列产物 bp退火温度 ℃染色体位置 1rs3022796-F GTATGGTGGGGAGAGCACAC rs3022796-R GAGTCAGGTCCAACCAACCC344 61 1 2rs3022825-F GGCACTGCAGTATTAGCCGA rs3022825-R CCTGGCATGTACTGTGAGGC299 60 1 3rs3022883-F AGTTTGGGGGAGGAACCCTG rs3022883-R AGGCAGGCATCATACATTGGA209 60 2 2GB/T45350—2025 表2 近交系小鼠35个SNP引物及退火温度(续) 序号 引物 引物序列产物 bp退火温度 ℃染色体位置 4rs3022953-FCATTTGACAAGGTATGCAGGGC rs3022953-R GTATTTTGTAGGGGCACCAGA198 59 3 5rs3022977-FATGAGAGGAACAACAAGCACGT rs3022977-RCCCCAAGATTTCTACACCAAAG385 59 4 6rs3023034-F TGAGTTTTCACTCTTGCTGGC rs3023034-RAGCCCTTCTGATAGTTGAACGAC249 60 5 7rs3023039-F CAGCCATACCACTCTGCTCC rs3023039-R GGTCAGAACCCATGTCCAGG459 61 5 8rs3023064-F GCCCAGCCAGTGGGTC rs3023064-RTGGCAATAATTGTATCTTGTGCCC153 58 6 9rs3023162-F TTTTCACTGTGTTCCCGTGAC rs3023162-R AGACCTAACAGGGAACAGGCA262 60 7 10rs3023177-FTTTGAGTTGCAGGGTTTTCCTG rs3023177-RGCCTTTACAGCCAAAGACTTATCA200 59 8 11rs3023203-F GGTCTCTTGGCATCTGGCAT rs3023203-R GAGCTTGTAGAGAGAACCCCT183 58 9 12rs3023226-F GTGACAACCCTCCTGGTGTA rs3023226-R AACTCCGTGTGGGGTAGTGA185 59 9 13rs3089984-FGCCTAACATCACTTTTTGGGAGC rs3089984-RGGAGCAATTAGAATCCCAGGTG199 60 10 14rs3089109-FTAACAAAGCTCTTCACTCCTCAAG rs3089109-RAATGGGTCTGTCAGAGTTTTCTCA191 59 10 15rs3088673-FACCATTCTTCTCAACTAAGTCTGCT rs3088673-R TGGTGATAGTGATGGGCTCT190 59 11 16rs3023251-FTCAGCATCTCCCTTAACCTTCTT rs3023251-R ACCAGCTCCTAGTGATGACA186 60 11 17rs3023342-F