ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T17816—2025 代替GB/T17816—1999 饲料中总抗坏血酸的测定 Determinationoftotalascorbicacidinfeeds 2025-08-01发布 2026-02-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T17816—1999《饲料中总抗坏血酸的测定 邻苯二胺荧光法》,与GB/T17816— 1999相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了邻苯二胺荧光法的检出限,增加了定量限(见第1章,1999年版的第1章); ———增加了高效液相色谱测定方法(见第4章); ———更改了邻苯二胺荧光法分析结果的计算及表示(见5.5.4,1999年版的第8章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:国粮武汉科学研究设计院有限公司。 本文件主要起草人:邵瑞、杜言、陈析羽、王博媛、陈梦莹、马生晖、汪忠艳、严宏岳、宿永波、邱惠娟、 常晓红、魏双正、刘小敏。 本文件及其所代替文件历次版本发布情况为: ———1999年首次发布为GB/T17816—1999; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T17816—2025 饲料中总抗坏血酸的测定 1 范围 本文件描述了饲料中总抗坏血酸测定的高效液相色谱法和邻苯二胺荧光法。 本文件高效液相色谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中L-抗坏血酸、D-异抗坏血 酸和总抗坏血酸的测定;邻苯二胺荧光法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中总抗坏血酸 的测定。 本文件不适用以酯化抗坏血酸形式添加的各种饲料中总抗坏血酸的测定。 本文件高效液相色谱法L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的检出限均为5mg/kg,定量限均为 20mg/kg;邻苯二胺荧光法的检出限为8mg/kg,定量限为25mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 高效液相色谱法 4.1 原理 试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶液提取,高效液相色谱仪测定,外标法定量。 4.2 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水:GB/T6682,一级。 4.2.2 L-半胱氨酸:优级纯。 4.2.3 磷酸二氢钾:色谱纯。 4.2.4 十六烷基三甲基溴化铵:色谱纯。 4.2.5 磷酸:色谱纯。 4.2.6 甲醇:色谱纯。 4.2.7 偏磷酸溶液(20g/L):称取20g偏磷酸,用水溶解并稀释至1L,混匀。于4℃保存,有效期为 1个月。 4.2.8 磷酸三钠溶液(100g/L):称取100g磷酸三钠,用水溶解并稀释至1L,混匀。 1GB/T17816—2025 4.2.9 L-半胱氨酸溶液(40g/L):准确称取4g(精确至0.01g)L-半胱氨酸(4.2.2),用水溶解并稀释至 100mL,混匀。临用现配。 4.2.10 磷酸二氢钾-十六烷基三甲基溴化铵溶液:称取6.8g磷酸二氢钾(4.2.3)和0.91g十六烷基三 甲基溴化铵(4.2.4),用水溶解并定容至1L,混匀。用磷酸调节pH至3.5,过0.45μm滤膜,超声脱气。 4.2.11 标准储备溶液(1mg/mL):分别准确称取L-抗坏血酸(CAS号:50-81-7;纯度不低于99.0%)、 D-异抗坏血酸(CAS号:89-65-6;纯度不低于99.0%)标准品各50mg(精确至0.01mg)分别于50mL 棕色容量瓶中,用偏磷酸溶液(4.2.7)溶解并定容,混匀。于2℃~8℃保存,有效期为1周。 4.2.12 标准中间溶液(100μg/mL):准确移取抗坏血酸标准储备溶液(4.2.11)各1mL于10mL棕色 容量瓶中,用偏磷酸溶液(4.2.7)稀释并定容,混匀。于2℃~8℃保存,有效期为1周。 4.2.13 标准系列溶液:准确移取适量标准中间溶液(4.2.12),用偏磷酸溶液(4.2.7)稀释并定容,混 匀,配制成质量浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的标准系 列溶液。临用现配。 4.2.14 微孔滤膜:0.45μm,水系。 4.3 仪器设备 4.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 4.3.2 分析天平:精度为0.01mg、0.1mg和0.01g。 4.3.3 超声波清洗器。 4.3.4 离心机:转速不低于4000r/min。 4.3.5 pH计:精度为0.01。 4.3.6 往复式振荡器:转速不低于200r/min。 4.4 样品 按GB/T20195制备试样,取样品至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的试验筛,充分混 匀,装入棕色、密闭容器中,避光保存,备用。 4.5 试验步骤 注意:试验全过程避光操作。 4.5.1 提取 平行做两份试验。称取0.5g~2g(精确至0.1mg)试样于50mL棕色容量瓶中,加入30mL偏磷 酸溶液(4.2.7),混匀。超声提取10min,冷却至室温,用偏磷酸溶液(4.2.7)定容,混匀。于4000r/min 离心5min,上清液备用。 4.5.2 还原 准确移取20mL提取液(4.5.1)于50mL离心管中,加入10mLL-半胱氨酸溶液(4.2.9),用磷酸三 钠溶液(4.2.8)调节pH至7.0~7.2,200r/min振荡5min。用磷酸调节pH至3.5,转移至50mL棕色 容量瓶中,用水定容,混匀。用微孔滤膜(4.2.14)过滤,立即测定。 4.5.3 测定 4.5.3.1 高效液相色谱参考条件 高效液相色谱参考条件如下: 2GB/T17816—2025 a) 色谱柱:C18柱,长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或性能相当者; b) 流动相:V[磷酸二氢钾-十六烷基三甲基溴化铵溶液(4.2.10)]+V[甲醇(4.2.6)]=99+1; c) 流速:1.0mL/min; d) 柱温:25℃; e) 进样量:20μL; f) 检测波长:263nm。 4.5.3.2 标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取标准系列溶液(4.2.13)和试样溶液(4.5.2)上机测定。L-抗坏血酸和 D-异抗坏血酸标准溶液的液相色谱图见附录A。 4.5.3.3 定性 以保留时间定性,试样溶液中待测物保留时间应与标准系列溶液(质量浓度相当)中待测物的保留 时间一致,其相对偏差在±2.5%之内。 4.5.3.4 定量 以标准系列溶液中的质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其相关系数应不低 于0.99。试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内,若超出范围,应将试样溶液用偏磷 酸溶液(4.2.7)稀释后重新测定。单点校准定量时,试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液质量浓度 相差不超过30%。 4.6 试验数据处理 4.6.1 L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸 试样中待测物的含量以质量分数w1i计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示。多点校准按公式(1)计 算;单点校准按公式(2)计算: w1i=ρi×V1×V3×1000 m1×V2×1000×f …………………………(1) 式中: ρi ———从标准曲线查得的试样溶液中待测物的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V1———试样溶液的定容体积,单位为毫升(mL); V3———试样溶液(V2)的定容体积,单位为毫升(mL); m1———试样质量,单位为克(g); V2———从试样溶液(V1)中分取的溶液体积,单位为毫升(mL); f———超出标准曲线范围后的稀释倍数; 1000———换算系数。 w1i=Ai×ρsi×V1×V3×1000 Asi×m1×V2×1000×f…………………………(2) 式中: Ai ———试样溶液中待测物的色谱峰面积; ρsi———标准溶液中待测物的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V1———试样溶液的定容体积,单位为毫升(mL); V3———试样溶液(V2)的定容体积,单位为毫升(mL); Asi———标准溶液中待测物的色谱峰面积; 3GB/T17816—2025 m1———试样质量,单位为克(g); V2———从试样溶液(V1)中分取的溶液体积,单位为毫升(mL); f———超出标准曲线范围后的稀释倍数; 1000———换算系数。 测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字。 4.6.2 总抗坏血酸 试样中总抗坏血酸含量以质量分数w2计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,按公式(3)计算: w2=wL-抗坏血酸+ωD-异抗坏血酸 …………………………(3) 4.7 精密度 在重复性条件下,两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不超过该算术平均值的10%。 5 邻苯二胺荧光法 5.1 原理 弱酸性条件下提取试样中的抗坏血酸,还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,与邻苯二胺 反应生成有荧光的喹喔啉,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度