ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T19539—2025 代替GB/T19539—2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定 DeterminationofochratoxinAinfeeds 2025-08-01发布 2026-02-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB//T19539—2004《饲料中赭曲霉毒素A的测定》,与GB/T19539—2004相比,除 结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围(见第1章,2004年版的第1章); b) 删除了薄层色谱法(见2004年版的第3章); c) 删除了酶联免疫吸附测定法(见2004年版的第4章); d) 增加了液相色谱-串联质谱法(见第4章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:广州汇标检测技术中心、全国畜牧总站。 本文件主要起草人:郝燕娟、杨雨澄、赵恩泽、王智民、罗梓峰、粟胜兰、梁淑珍、林翠纹、罗群、龙志曦、 沈达荣、丁桢灏、潘浣钰、谢书越、何绮霞。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2004年首次发布为GB/T19539—2004; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T19539—2025 饲料中赭曲霉毒素A的测定 1 范围 本文件描述了饲料中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料、混合型饲料添加剂和植物性饲 料原料中赭曲霉毒素A的测定。 本文件检出限为0.2μg/kg,定量限为0.5μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的赭曲霉毒素A用乙腈水提取,经免疫亲和柱净化,用液相色谱-串联质谱仪检测,基质匹 配标准溶液校准,外标法定量。 5 试剂或材料 警告: a) 凡接触赭曲霉毒素A的容器,需浸入4%次氯酸钠溶液,半天后清洗备用; b) 为了安全,分析人员操作时要戴上医用乳胶手套。 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 5.1 水:GB/T6682,一级。 5.2 甲醇:色谱级。 5.3 氢氧化钾溶液:称取5.6g氢氧化钾,加入适量水溶解,用水定容至100mL。 5.4 磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶于 900mL水中,用氢氧化钾溶液(5.3)调节pH至7.0,用水定容1L,混匀。 5.5 提取液:量取800mL乙腈和200mL水,混匀。 5.6 洗脱液:量取2mL乙酸,用甲醇定容至100mL,混匀。 1GB/T19539—2025 5.7 甲酸铵溶液(0.005mol/L):称取0.3152g甲酸铵,加适量水溶解,用水定容至1000mL,混匀。 5.8 标准储备溶液(100μg/mL):准确称取(CAS号303-47-9,纯度≥99%)标准品10mg(精确至 0.01mg)于100mL棕色容量瓶中,用甲醇(5.2)溶解并定容至刻度,混匀。-18℃以下避光保存,有 效期6个月。或使用标准物质/标准样品。 5.9 标准中间溶液(1μg/mL):准确移取标准储备液(5.8)1mL,置于100mL棕色容量瓶中,用甲醇 (5.2)稀释至刻度,混匀。-18℃以下避光保存,有效期3个月。 5.10 标准系列溶液:分别准确移取适量标准中间溶液(5.9),用甲醇(5.2)稀释定容,混匀,制备成质量 浓度分别为0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L标准系列溶液。2℃~8℃避光保 存,有效期7d。 5.11 赭曲霉毒素A免疫亲和柱:柱容量≥100ng,或性能相当者。 5.12 中速定性滤纸:无荧光特性。 5.13 微孔滤膜:0.22μm,有机系。 5.14 精密pH试纸:5.5~9.0。 6 仪器设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI)。 6.2 超声清洗仪。 6.3 分析天平:精度0.01g、0.01mg。 6.4 离心机:转速不低于8000r/min。 6.5 固相萃取装置。 6.6 氮吹仪。 6.7 涡旋混合器。 7 样品 按GB/T20195的规定制备样品,至少200g。固体样品粉碎使其全部通过1mm孔径的试验 筛,充分混匀,装入密闭容器中避光保存。选取类型相同、均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值 小于方法检出限30%的饲料样品作为空白样品。 8 试验步骤 注意:试验过程全程避光操作。 8.1 提取 平行做两份试验。称取25g试样(精确至0.01g),置于200mL具塞锥形瓶中,加100mL提取液 (5.5),超声提取30min,冷却至室温,过滤。准确移取10mL滤液于50mL容量瓶中,用PBS(5.4)稀 释至刻度,混匀,8000r/min离心5min,取上清液,备用。若试样溶液pH超出6.5~8.5范围,应准确 移取20mL试样溶液调节pH至6.5~8.5再进行净化处理。 8.2 净化 将免疫亲和柱(5.11)连接于10mL玻璃定量管下。准确移取20mL试样溶液(8.1)于玻璃定量管 2GB/T19539—2025 中,调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至3mL以上空气通过柱体。分 别以10mLPBS(5.4)、10mL水清洗免疫亲和柱,弃去全部流出液,并使3mL以上空气通过免疫亲和 柱。分两次加2mL洗脱液(5.6),流速不超过1mL/min,收集洗脱液于玻璃试管中于45℃氮气吹干。 准确加入1mL甲醇(5.2),涡旋混匀,使样品完全复溶,微孔滤膜(5.13)过滤,备用。 8.3 基质匹配标准系列溶液的制备 称取空白试样,按照8.1、8.2处理得到空白试样溶液。准确移取0.5mL的标准系列溶液(5.10)于 45℃氮气吹干,准确加入0.5mL基质空白溶液,涡旋混匀。配制成质量浓度分别为0.25μg/L、 0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L的基质匹配标准系列溶液。 8.4 测定 8.4.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下。 a) 色谱柱:C18柱,柱长100mm,内径2.1mm,粒径1.7μm,或性能相当者。 b) 柱温:30℃。 c) 流速:0.3mL/min。 d) 进样量:2μL。 e) 流动相:A相为甲酸铵溶液(5.7);B相为甲醇(5.2)。梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间/min A相(体积分数)/% B相(体积分数)/% 0.0 90 10 1.0 90 10 2.5 10 90 4.5 10 90 5.5 90 10 7.0 90 10 8.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下。 a) 电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI+)。 b) 检测方式:多反应监测(MRM)。 c) 毛细管电压:0.5kV。 d) 离子源温度:150℃。 e) 脱溶剂温度:450℃。 f) 干燥气流量:氮气900L/h。 多反应监测(MRM)定性离子对、定量离子对及其他参考质谱条件见表2。 3GB/T19539—2025 表2 多反应监测(MRM)定性离子对、定量离子对及其他参考质谱条件 被测物名称 母离子m/z 子离子m/z 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 赭曲霉毒素A404.1 238.8a15 20 404.1 357.8 15 14 a定量离子。 8.4.3 基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(8.3)和试样溶液(8.2)上机测定。赭曲霉毒 素A标准溶液定量离子色谱图见附录A中图A.1。 8.4.4 定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中目标物的保留时间相对偏差应在±2.5% 之内。根据表2选择的定性离子对,比较试样图谱中目标物定性离子的相对离子丰度与质量浓度接近 的基质匹配标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定 为试样中存在对应的目标物。 表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 最大允许偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 8.4.5 定量 以基质匹配标准系列溶液的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标,绘制曲线,相关系数不应低于 0.99。试样溶液中待测物的响应值应在标准曲线的线性范围内,如超出线性范围,应重新测定。单点校 准定量时,试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。 9 试验数据处理 试样中赭曲霉毒素A的含量以质量分数w计,数值以微克每千克(μg/kg)表示。多点校准按 式(1)计算,单点校准按式(2)计算: w=ρ×V1×V3×V5×1000 V2×V4×m×1000…………………………(1) 式中: ρ ———从基质匹配标准曲线查得的试样溶液中赭曲霉毒素A的质量浓度,单位为微克每升 (μg/L); V1———试样提取溶液总体积,单位为