ICS13.300 CCSA80 中华人民共和国国家标准 GB/T46144—2025 化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃 细胞系(RTgill-W1)试验 Chemicals—Fishcelllineacutetoxicity—TheRTgill-W1celllineassay 2025-08-29发布 2025-12-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义、缩略语 1 ……………………………………………………………………………………… 4 试验原理 2 ………………………………………………………………………………………………… 5 受试物信息 2 ……………………………………………………………………………………………… 6 参比物 3 …………………………………………………………………………………………………… 7 试验准备 3 ………………………………………………………………………………………………… 8 试验程序 3 ………………………………………………………………………………………………… 9 数据分析和结果评价 9 …………………………………………………………………………………… 10 质量保证与质量控制 9 …………………………………………………………………………………… 11 结果报告 10 ……………………………………………………………………………………………… 附录A(规范性) 试验培养基和试剂的配制 11 …………………………………………………………… 附录B(资料性) RTgill-W1细胞的传代和冻存 13 ……………………………………………………… 参考文献 16 …………………………………………………………………………………………………… ⅠGB/T46144—2025 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位:广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、生态环境部固体废物 与化学品管理技术中心、上海市检测中心、生态环境部南京环境科学研究所、中国水产科学研究院珠江 水产研究所、中检科健(天津)检验检测有限责任公司、中国化工经济技术发展中心。 本文件主要起草人:梅承芳、许玉洁、许玫英、窦从从、王蕾、王庆、滕晓明、王鹏、刘纯新、陈晓倩、 林木青、王英英、余明喧、王晓兵、许丽红、杨婧、邓通初、钟贞、郭佳锋、郝长富、田升江。 ⅢGB/T46144—2025 化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃 细胞系(RTgill-W1)试验 1 范围 本文件描述了化学品鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系(RTgill-W1)试验方法。 本文件适用于测试和评价化学品对鱼类细胞系的急性毒性。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T21852 化学品 分配系数(正辛醇-水) 高效液相色谱法试验 GB/T21853 化学品 分配系数(正辛醇-水) 摇瓶法试验 GB/T22052 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法 GB/T22228 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定 静态法 GB/T22229 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定 蒸气压平 衡法 GB/T27860 化学品 高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数 GB/T42426 化学品 蒸气压试验 3 术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 细胞活力 cellviability 处于健康状态(即代谢活跃,细胞膜和细胞器完好)的细胞百分比。 3.1.2 效应浓度 effectconcentration;ECx 在给定试验周期内,与阴性对照或溶剂对照相比,引起细胞活力x%变化的受试物的浓度。 3.1.3 L-15完全培养基 L-15completeculturemedium LeibovitzL-15培养基中添加5%胎牛血清和可选抗生素。 注:常用的抗生素有0.5%庆大霉素。 3.1.4 L-15/ex培养基 L-15/exmedium 无蛋白培养基,含有与LeibovitzL-15培养基相同的盐、半乳糖和丙酮酸。 注:用于细胞暴露试验。 1GB/T46144—2025 3.1.5 半数致死浓度 medianlethalconcentration;LC50 在给定试验周期内,导致50%受试生物死亡的受试物浓度。 3.1.6 最低可观察效应浓度 lowestobservedeffectconcentration;LOEC 在给定试验周期内,与对照组相比,在统计学意义上对受试物产生显著效应(p小于0.05)的最低受 试物浓度。 3.1.7 无可观察效应浓度 noobservedeffectconcentration;NOEC 在给定试验周期内,与对照组相比,在统计学意义上对受试物未产生显著效应(p大于或等于0.05) 的最高受试物浓度。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CFDA-AM:5-羧基荧光素二乙酸乙酰毒性甲酯(5-carboxyfluoresceindiacetateacetoxymethyl ester) DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide) FBS:胎牛血清(FetalBovineSerum) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) 3,4-DCA:3,4-二氯苯胺(3,4-Dichloroaniline) 4 试验原理 采用特别设计的无蛋白培养基(L-15/ex培养基)在24孔板中培养融合单层的RTgill-W1细胞,在 黑暗环境中暴露于受试物中24h。针对同一组细胞,采用三种不同的荧光指示染料检测细胞活力以表 明细胞毒性。三种染料包括:基于刃天青的染料用于评估细胞代谢活性;CFDA-AM用于评估细胞膜的 完整性;中性红用于评估溶酶体膜的完整性。通过测定上述染料在培养基中的荧光来评估细胞活力。 在暴露开始(0h)和结束(24h)时对培养板孔中的暴露培养基进行浓度分析,以确定受试物实测浓度的 几何平均值。结果以受试物浓度组相对未暴露的对照组中细胞活力的百分比来表示。由此得到的浓 度-效应曲线用于确定导致细胞活力损失50%的效应浓度,即EC50值。也可获得其他效应参数,如由非 线性回归得到的无毒浓度,或由假设检验(方差分析)得到的LOEC或NOEC。 5 受试物信息 受试物信息包括: a) 结构式; b) 分子量; c) 纯度; d) 在试验条件下的稳定性; e) 水中解离常数(pKa),具体方法见参考文献[3]; f) 按照GB/T27860测定的有机碳分配系数(Koc),也可用其他方法测定的结果,见参考文献[2]; g) 按照GB/T21852或GB/T21853方法测定的正辛醇/水分配系数(Pow); h) 按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426方法测定的蒸气压,并计算亨利常 2GB/T46144—2025