ICS07.080 CCSA40 中华人民共和国国家标准 GB/T46945—2025 单核苷酸多态性位点分析 基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱法 Determinationofsinglenucleotidepolymorphism— Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry 2025-12-31发布 2026-07-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位:中国测试技术研究院、融智生物科技(青岛)有限公司、西华大学、山东英盛生物技 术有限公司、兰州百源基因技术有限公司、核工业四一六医院、成都中医药大学、北京毅新博创生物科技 有限公司、烟台至公生物医药科技有限公司、四川中测标物科技有限公司、国健药业(深圳)集团有限公 司、四川振兴检测科技股份有限公司。 本文件主要起草人:周李华、邹燕、李晨、张园园、何洋、冯振、马庆伟、石波、易艳、姜展樾、戴继海、 沈晓曼、张成伟、刘东芳、谢坤、吴彩骏、赵悦、郑晓玲、辛倩、申清瑜、张蒙、罗婷婷、张惠。 ⅠGB/T46945—2025 单核苷酸多态性位点分析 基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱法 1 范围 本文件描述了用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析单核苷酸多态性(SNP)位点的试验 方法。 本文件适用于定性分析核酸序列间SNP的差异。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism;SNP 基因组水平上单个核苷酸的变异而引起的DNA序列的改变,造成包括人类在内的物种之间染色 体基因组的多样性。 注:这种变异由单个碱基的转换(C←→T,在其互补链上则为G←→A)或颠换(C←→A,G←→T,C←→G,A←→ T)所引起,也能由碱基的插入或缺少所致。 3.1.2 等位基因特异性延伸引物 allele-specificextensionprimer ASE引物 以SNP位点为模板增加一个碱基,用于SNP位点的碱基质量区分的一段寡核苷酸单链。 3.2 缩略语 下列缩列语适用于本文件。 ASE:等位基因特异性延伸(allele-specificextension) ddNTP:双脱氧核糖核苷三磷酸(dideoxynucleosidetriphosphate,dideoxyNTP) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxynucleosidetriphosphate,dideoxyNTP) MALDI-TOFMS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ 1GB/T46945—2025 ionizationtime-of-flightmassspectrometry) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SAP:虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase) SNP:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms) Tm:熔解温度(meltingtemperature) 3-HPA:3-羟基-2-吡啶甲酸(3-hydroxy-2-pyridinecarboxylicacid) 4 原理 样本经核酸提取后,通过PCR技术扩增,获得含有SNP位点的DNA片段。通过等位基因特异性 延伸反应,不同SNP等位基因产生不同质量的延伸产物。利用MALDI-TOFMS检测延伸产物的分子 量,从而确定该位点的碱基分型。 5 试剂或耗材 5.1 试剂 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 5.1.1 无酶水:不含具有活性的核酸酶和蛋白酶的一级水。 5.1.2 SAP酶。 5.1.3 ASE酶。 5.1.4 PCR引物(PAGE级)。 5.1.5 ASE引物(PAGE级)。 5.1.6 PCR预混液(含TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP的混合液)。 5.1.7 SAP缓冲液。 5.1.8 ddNTP混合液。 5.1.9 ASE酶缓冲液。 5.1.10 3-HPA基质溶液。 5.1.11 核酸提取试剂或等效试剂盒。 5.2 标准样品/标准物质 5.2.1 分子量标准品:国家有证标准样品/标准物质。 5.2.2 阴性对照:国家有证标准样品/标准物质,或经测序确认的质量控制物质。 5.2.3 阳性对照:国家有证标准样品/标准物质,或经测序确认的质量控制物质。 5.3 材料 阳离子交换树脂。 6 仪器设备 6.1 MALDI-TOFMS:质谱仪的质量范围需满足最大值大于或等于10000m/z;质量分辨率大于或 等于500(质量范围1500m/z~10000m/z)。 6.2 超净工作台或生物安全柜。 6.3 PCR仪。 2GB/T46945—2025 6.4 涡旋振荡仪。 6.5 高速离心机。 6.6 旋转混匀仪。 6.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.8 自动化核酸提取仪。 6.9 自动点样仪。 7 实验步骤 7.1 样品预处理 7.1.1 样品类型 可供使用的样品类型包括(但不限于)含有核酸成分的动植物组织、口腔拭子、唾液、血液、血卡等。 MALDI-TOFMS分析单核苷酸多态性位点方法流程见附录A。 7.1.2 核酸提取 根据实验条件及核酸提取实验规程,可使用商品化核酸提取试剂盒,按核酸检测试剂盒说明书要求 进行操作,或按规程手动提取核酸。 7.1.3 核酸浓度和纯度测定 按GB/T34796方法测定并计算DNA的浓度,判定DNA的纯度。当浓度为5ng/μL~ 50ng/μL,A260/A280比值在1.7~1.9时,适宜于PCR扩增及后续反应。 7.2 PCR扩增 将PCR预混液、PCR引物、提取的核酸或阴性对照及阳性对照(以下简称DNA模板)平衡至室 温,充分混匀后离心。按特定比例在离心管中配制除DNA模板外的PCR扩增反应混合液,再次混匀 后分装至PCR反应管中,随后加入DNA模板并进行混匀。所有上述操作应在冰盒上完成,具体反应 体系与程序见附录B。 将PCR反应管置于PCR仪中,运行PCR反应程序。PCR反应结束后,瞬时离心。 7.3 SAP消解反应 将SAP酶和SAP缓冲液平衡至室温,瞬时离心。按特定比例在离心管中配制SAP消解反应混合 液,充分混匀后加入PCR反应孔中。上述操作应在冰盒上完成,具体反应体系与程序见附录B。 将SAP反应管板置于PCR仪中,运行SAP反应程序。SAP反应结束后,瞬时离心。 7.4 ASE延伸反应 将ASE酶和缓冲液、ddNTP混合液和ASE引物平衡至室温,瞬时离心,按一定的比例配制ASE 反应混合液,混匀后加入PCR反应孔中。上述操作应在冰盒上完成,具体反应体系与程序见附录B。 将ASE反应管置于PCR仪中,运行ASE反应程序。ASE反应结束后,瞬时离心。 7.5 纯化 根据不同厂家设备要求进行纯化。在每个反应孔中加入适量的无酶水与分子量标准品,树脂纯化 或者其他方式纯化后待测。 3GB/T46945—2025 7.6 靶板点样及MALDI-TOFMS测试 将纯化后的产物与基质混合,取适量体积溶液点在靶板上(按不同靶板规格,取样量在50nL~ 2μL)干燥结晶后放入MALDI-TOFMS,正离子模式测试,目标物信噪比应大于或等于10。不同仪器 的靶板点样操作可能有所不同,应按实际使用的仪器进行靶板点样及MALDI-TOFMS测试。 7.7 平行实验 按7.1~7.6的规定对同一试样进行两次平行测定,且两次测定结果应保持一致。如两次测定结果 不一致,应重新进行样本处理与测定。 7.8 结果分析 通过质谱软件,按以下步骤进行结果分析: a) 引物信息导入:获取目标SNP位点的理论m/z值; b) 质量轴校准:采用相对分子质量标准品进行内标校正,质量精度小于或等于50×10-6; c) 位点分型:按质谱峰图进行SNP定性分析,输出样本基因型数据; d) 结果判读:基于峰图m/z值与信号强度,判定各样本的基因型(野生型、变异型或杂合型)。 8 质量控制 每次实验都应同时进行阴性与阳性质控品的检测,并确保检测结果与SNP位点信息相符。 为防止交叉污染,相关措施应按GB/T19495.2执行。 4GB/T46945—2025