ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T20191—2025 代替GB/T20191—2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 MicrobiologicalexaminationofLactobacillusacidophilusinfeeds 2025-12-31发布 2026-07-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T20191—2006《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验》,与GB/T20191—2006相 比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围(见第1章,2006年版的第1章); b) 更改了试样制备方法(见7.1,2006年版的6.2.1); c) 更改了嗜酸乳杆菌的培养条件及培养时间(见7.3,2006年版的6.2.6); d) 更改了试验数据处理方法(见第8章,2006年版的第8章); e) 更改了嗜酸乳杆菌培养基种类及制备方法(见A.1,2006年版的A.1); f) 增加了嗜酸乳杆菌分子生物学鉴定方法(见B.2)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:湖北景瑞天恒生物科技有限公司、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、湖北凯 能生物科技有限公司、北京市农林科学院、湖北省兽药监察所、国家食品安全风险评估中心、北京大北农 科技集团股份有限公司、北京新科开源基因科技有限公司。 本文件主要起草人:陈晓峰、饶正华、徐朋朋、张董燕、文静静、韩小敏、刘雪连、王建华、王峻、林燕、 刘滢、别君艳、梁洺源、刘娜。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2006年首次发布为GB/T20191—2006; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T20191—2025 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 1 范围 本文件描述了饲料中嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的微生物学检验方法。 本文件适用于含有嗜酸乳杆菌的饲料中嗜酸乳杆菌活菌总数的计数及鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30989—2014 高通量基因测序技术规程 GB/T40664—2021 用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求 GB/T42959 饲料微生物检验 采样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和培养基 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 4.1 水:GB/T6682,三级。 4.2 MRS琼脂培养基:按附录A中A.1配制。 4.3 乳杆菌糖发酵管:按A.2配制。 4.4 七叶苷培养基:按A.3配制。 4.5 革兰氏染色液:按A.4配制。 4.6 生理盐水:按A.5配制。 5 设备和材料 5.1 培养箱:36℃±1℃。 5.2 天平:感量0.1g和0.01g。 5.3 恒温振荡器。 5.4 旋涡混合器。 5.5 无菌培养皿:直径90mm。 5.6 厌氧培养装置:厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。 5.7 无菌吸管:容量为0.1mL、1mL或相当规格的移液器以及配套的无菌吸头。 1GB/T20191—2025 5.8 三角瓶:容量为250mL、500mL。 5.9 显微镜:1000倍。 5.10 菌株:嗜酸乳杆菌。 6 试样 按照GB/T42959执行。 7 试验步骤 7.1 试样制备 以无菌操作称取饲料(饲料添加剂除外)试样25g或以无菌吸管吸取25mL,置于装有225mL灭 菌生理盐水(4.6)的500mL无菌三角瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,制成1∶10试样稀释匀 液。在恒温振荡器200r/min振荡30min。取1mL1∶10或1∶100试样稀释匀液注入含有9mL灭 菌生理盐水(4.6)的试管中,在旋涡混合器上混匀,此液为1∶100或1∶1000的试样稀释匀液。同法制 备10倍递增系列试样稀释匀液。每递增稀释一次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 称量饲料添加剂1g试样,置于装有99mL灭菌生理盐水(4.6)的250mL无菌三角瓶(瓶内预置适 当数量的无菌玻璃珠)中,制成1∶100试样稀释匀液。 注:经特殊技术(如包埋技术)处理的试样在相应技术/工艺要求下进行有效前处理。 7.2 接种 选择2个~3个适宜稀释级的试样稀释匀液,吸取0.1mL该试样稀释匀液滴于预先灭菌并充分干 燥的MRS琼脂培养基(4.2)平板上,使用无菌涂布棒快速地涂布均匀。每个稀释级涂布2个平板。同 时吸取0.1mL灭菌生理盐水(4.6)进行同样涂布,作为空白对照。从试样稀释后到平板涂布应在 15min内完成。 7.3 培养 涂布结束后水平放置10min,将平板倒置放入厌氧培养装置(5.6)里,36℃±1℃培养。一般选择 培养48h±2h,若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。 7.4 菌种鉴定 7.4.1 菌落形态观察 典型的嗜酸乳杆菌菌落微白色,圆形,凸起,表面湿润,边缘整齐。 7.4.2 菌种纯化 在同一稀释级内,挑取5个嗜酸乳杆菌疑似菌落,分别划线转接至MRS琼脂培养基(4.2)平板,于 36℃±1℃、48h±2h培养。从每一平板中选取至少1个良好分离的典型菌落,转接保存。 7.4.3 菌体镜检观察 挑取典型菌落进行革兰氏染色,在显微镜(5.9)下观察。嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性、无芽孢杆菌。 7.4.4 生理生化试验 将挑选纯化的菌落进行生理生化试验,特征结果应符合附录B中表B.1。 2GB/T20191—2025 生理生化试验选用商品化生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。 7.4.5 分子生物学鉴定 若形态学特征和生理生化试验不能确定为嗜酸乳杆菌,按B.2进行分子生物学鉴定。 7.5 菌落计数 选取典型菌落数在30CFU~300CFU之间的平板,记录菌落总数。若选择的最高稀释级平板上 的菌落数均大于300CFU,需选择更高稀释级重新测定;若选择的最高稀释级平板上的菌落数均小于 30CFU,需选择更低稀释级重新测定。 8 试验数据处理 8.1 结果计算 8.1.1 若只有一个稀释级平板上的菌落数在30CFU~300CFU内,计算两个平板菌落数的平均值,再 将平均值乘以相应稀释因子,作为每克或每毫升试样中嗜酸乳杆菌活菌数结果。 8.1.2 若有两个连续稀释级的平板菌落数在30CFU~300CFU内,按公式(1)计算。 N=C1+C2 (n1+0.1n2)×d…………………………(1) 式中: N———试样中嗜酸乳杆菌活菌数,单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升 (CFU/mL); C1———第一稀释级(低稀释倍数)平板证实为嗜酸乳杆菌的菌落数之和; C2———第二稀释级(高稀释倍数)平板证实为嗜酸乳杆菌的菌落数之和; n1———第一稀释级(低稀释倍数)平板个数; n2———第二稀释级(高稀释倍数)平板个数; d———稀释度(第一稀释级)。 8.1.3 若所有稀释级平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 8.2 结果表示 采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法修约,以10的指数表示。 根据菌落计数结果出具报告,报告单位以菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升 (CFU/mL)表示。 3GB/T20191—2025 附 录 A (规范性) 培养基及试剂 A.1 MRS琼脂培养基 A.1.1 MRS琼脂培养基组成成分 蛋白胨 10.0g 牛肉浸粉 10.0g 酵母浸粉 5.0g 柠檬酸三铵 2.0g 葡萄糖 20.0g 吐温80 1.0mL 乙酸钠(CH3COONa·3H2O) 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4·7H2O) 2.0g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.1g 硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.05g 琼脂 15g A.1.2 制法 将上述成分加入1000mL蒸馏水中,加热溶解,调整pH至6.2±0.2,分装后121℃高压灭菌 15min。 A.2 乳杆菌糖发酵管 A.2.1 成分 牛肉浸粉 5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母浸粉 5.0g 吐温80 0.5mL 琼脂 1.5g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL 蒸馏水 1000mL A.2.2 制法 按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121℃高压灭菌15min。 4GB/T20191—2025