ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T46929—2025 饲料中胆汁酸的测定 Determinationofbileacidsinfeeds 2025-12-31发布 2026-07-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、四川威尔检测技术股份有限公司、 上海海洋大学。 本文件主要起草人:王敏、张凤枰、曹晨、韩雨轩、王鑫、赵勇、杨发树、李明、张璐、吴旭干、刘海泉。 ⅠGB/T46929—2025 饲料中胆汁酸的测定 1 范围 本文件描述了饲料中胆汁酸的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。 本文件液相色谱-串联质谱法适用于配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中胆汁酸(猪胆酸、猪去氧胆 酸、鹅去氧胆酸)的测定,高效液相色谱法适用于添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中胆汁酸(猪胆 酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸)的测定。 本文件猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸液相色谱-串联质谱法的定量限均为0.10mg/kg;高效液 相色谱法添加剂预混合饲料的定量限均为100mg/kg,混合型饲料添加剂的定量限均为1000mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 液相色谱-串联质谱法 4.1 原理 试样中的胆汁酸用乙酸甲醇溶液提取,经固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,基质匹配标 准曲线校准,外标法定量。 4.2 试剂或材料 除另有说明外,仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水:GB/T6682,一级。 4.2.2 甲醇:色谱纯。 4.2.3 正己烷:分析纯。 4.2.4 乙腈:色谱纯。 4.2.5 甲酸:色谱纯。 4.2.6 0.1%乙酸甲醇溶液:移取1.0mL乙酸,用甲醇定容至1000mL,混匀。 4.2.7 50%乙腈溶液:移取50mL乙腈(4.2.4),用水定容至100mL,混匀。 4.2.8 0.1%甲酸溶液:移取1.0mL甲酸,用水定容至1000mL,混匀。 4.2.9 0.1%甲酸乙腈溶液:移取1.0mL甲酸,用乙腈(4.2.4)定容至1000mL,混匀。 1GB/T46929—2025 4.2.10 标准储备溶液(1mg/mL):称取猪胆酸(CAS号:547-75-1,纯度不低于97.0%)、猪去氧胆酸 (CAS号:83-49-8,纯度不低于99.0%)和鹅去氧胆酸(CAS号:474-25-9,纯度不低于95.0%)标准品各 10mg(精确至0.01mg),分别置于10mL容量瓶中,用甲醇(4.2.2)溶解并定容,混匀。-18℃以下保 存,有效期6个月。 4.2.11 混合标准中间溶液(10μg/mL):分别准确移取猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸标准储备溶液 (4.2.10)各1mL于100mL容量瓶中,用甲醇(4.2.2)稀释、定容,混匀。临用现配。 4.2.12 亲脂亲水平衡固相萃取柱:500mg/6mL,或性能相当者。 4.2.13 微孔滤膜:0.22μm,有机系。 4.3 仪器设备 4.3.1 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI)。 4.3.2 分析天平:精度0.001g和0.00001g。 4.3.3 涡旋振荡器。 4.3.4 离心机:转速不低于10000r/min。 4.3.5 超声波清洗机。 4.3.6 氮吹仪。 4.4 样品 按照GB/T20195规定制备至少200g样品,粉碎使其全部通过0.425mm的试验筛,充分混匀,装 入密闭容器中,备用。选取类型相同,均匀一致且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限 30%的饲料样品,作为空白样品。 4.5 试验步骤 4.5.1 提取 平行做两份试验。称取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料试样5g(精确至0.001g),置于50mL离 心管中,加入20mL0.1%乙酸甲醇溶液(4.2.6),涡旋振荡5min,超声5min,10000r/min离心5min, 上清液转移至50mL容量瓶中,残渣中加入20mL0.1%乙酸甲醇溶液(4.2.6)重复提取1次,合并上清 液,用0.1%乙酸甲醇溶液(4.2.6)定容(V),混匀,静置。准确移取5mL(V1)上清液,加入5mL正己烷 (4.2.3),涡旋混匀,10000r/min离心3min,除去上层溶液后,加水至10mL,备用。 4.5.2 净化 固相萃取柱(4.2.12)依次用5mL甲醇(4.2.2)和5mL水活化,取备用液(4.5.1)全部过柱,依次用 5mL水淋洗,5mL甲醇(4.2.2)洗脱,收集洗脱液,40℃氮吹至近干,用50%乙腈溶液(4.2.7)定容至 5mL(V2),涡旋混合2min,过微孔滤膜(4.2.13),待测。 4.5.3 基质匹配混合标准系列溶液的制备 取空白样品,按4.5.1和4.5.2处理得到空白基质溶液,准确移取混合标准中间溶液(4.2.11)适量, 用空白基质溶液进行逐级稀释,配制成质量浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、200ng/mL基质匹配混合标准系列溶液。 4.5.4 测定 4.5.4.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: 2GB/T46929—2025 a) 色谱柱:三官能团C18烷基键合(T3)柱,柱长100mm,柱内径2.1mm,粒度1.8μm,或性能相 当者; b) 柱温:室温; c) 流速:0.4mL/min; d) 进样量:5μL; e) 流动相:A相为0.1%甲酸溶液(4.2.8),B相为0.1%甲酸乙腈溶液(4.2.9),梯度洗脱程序见 表1。 表1 梯度洗脱程序 时间 min流动相A %流动相B % 0 90 10 3.0 90 10 5.0 10 90 9.0 10 90 10.5 90 10 4.5.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下: a) 电离方式:电喷雾电离,负离子模式; b) 扫描方式:多反应监测(MRM); c) 离子源温度:500℃; d) 电喷雾电压:-3000V。 多反应监测(MRM)定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表2。 表2 多反应监测(MRM)定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量 待测物名称定性离子对 m/z定量离子对 m/z去簇电压 V碰撞能量 eV 猪胆酸407>389 407>407407>407-75 -42 -75 -11 鹅去氧胆酸391>391 391>355391>391-75 -5 -75 -13 猪去氧胆酸391>391 391>355391>391-75 -5 -75 -13 4.5.4.3 混合标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配混合标准系列溶液(4.5.3)和试样溶液(4.5.2)上机测定。基 质匹配混合标准溶液中猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的定量离子色谱图见附录A。 3GB/T46929—2025 4.5.4.4 定性测定 在相同试验条件下,试样溶液中待测物的保留时间应与基质匹配混合标准系列溶液(质量浓度相 当)中待测物的保留时间一致,其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对,比较试样谱图 中待测物监测离子对的相对离子丰度与浓度接近的基质匹配混合标准系列溶液中对应的监测离子对的 相对离子丰度,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。 表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 最大允许偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 4.5.4.5 定量测定 以基质匹配混合标准溶液中待测组分的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线, 作单点或多点校准,按外标法计算试样中待测组分的含量。基质匹配混合标准溶液与试样溶液中待测 物的响应值均应在仪器检测的线性范围内,如超出线性范围,应重新测定。单点校准定量时,试样溶液 中待测组分质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过30%。 4.6 试验数据处理 样品中待测物含量以wi计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,多点校准按式(1)计算,单点校准按 式(2)计算。 wi=ρi×V×V2 m×V1×1000…………………………(1) 式中: ρi ———由标准曲线得到的试样溶液中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的质量浓度,单位为纳克 每毫升(ng/mL); V———试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); V2———氮气吹干后复溶溶液体积,单位为毫升(mL); m———样品质量,单位为克(g); V1———净化时所用试样提取溶液的体积,单位为毫升(mL); 1000———换算系数。 wi=Ai×V×ρst×V2 Ast×m×V1×1000…………………………(2) 式中: Ai ———试样溶液中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的峰面积值; V———试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); ρst———猪胆酸、猪去氧